硬脂酸改性蘇云金桿菌伴孢晶體蛋白對其抗紫外線作用及殺蟲活性的影響

謝烽，林婷，胡斌，朱瞬瞬，陳夢麗，喬麗雅，朱國念

(浙江大學 農藥與環境毒理研究所，浙江 杭州 310058)

蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthringiensis，Bt)是一種革蘭氏陽性菌，在形成芽孢的同時能產生伴孢晶體，又稱殺蟲晶體蛋白(Insecticidal Crystal Proteins，ICPs)，對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目昆蟲及動植物寄生蟲線蟲等有特異性毒殺作用，而對人畜無害，不污染環境，在農林衛生害蟲防治中應用廣泛[1-3]。雖然Bt作為微生物殺蟲劑在全球范圍內已經大面積推廣應用，但也存在藥效不穩定的普遍現象，Bt殺蟲的主要活性成分伴孢晶體極易受到溫度、pH值、紫外線等外界因素的影響而降低其殺蟲活性[4-6]。有研究表明，對Bt-HD1菌株經過紫外線輻射12 h后，發現其對棉鈴蟲幼蟲毒力喪失[7]。由于Bt制劑具有藥效不穩定、田間持效性短等缺點，已成為影響Bt在我國農業生產中實際用于推廣的主要制約因素。本研究利用硬脂酸作為改性劑，對Bt伴孢晶體進行表面包覆改性，并對改性后的產物進行表征和抗紫外線能力的測試，旨在為發展高效、安全的Bt生物農藥提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株

蘇云金芽胞桿菌為本實驗室分離保藏的菌株。

1.1.2 供試蟲源

二化螟由本實驗室從浙江金華市水稻田中采集，室內培養繁殖。其培養條件為：相對濕度70%，溫度(25±1) ℃，光照周期L∶D為16 h∶8 h。

1.1.3 培養基

液體LB培養基和PM培養基均參照文獻[8]配制，用于Bt細菌的發酵培養。

1.2 伴孢晶體的分離與純化

Bt菌株固體平板活化24 h，30 ℃，200 r·min-1液體搖瓶培養，至鏡檢晶孢完全分離，參考液體雙水相體系分離法[9]分離晶體蛋白。將分離得到的BT晶體蛋白用去離子水洗滌2遍后，重新懸浮于去離子水中備用。

1.3 伴孢晶體的覆膜改性

稱取一定量的硬脂酸溶于正丁醇中，配成6%的硬脂酸-正丁醇溶液。將蘇云金芽孢桿菌的伴孢晶體與硬脂酸按1∶1的質量比混合，40 ℃條件下以600 r·min-1的轉速攪拌1 h，靜置沉淀，傾去上層清液，用乙醇清洗沉淀，洗掉多余的硬脂酸，收集沉淀，35 ℃溫度下烘干即得到硬脂酸改性的Bt伴孢晶體。

1.4 紫外線照射對改性前后伴孢晶體殺蟲毒性的影響

將覆膜改性前后的Bt伴孢晶體蛋白分別置于培養皿中，紫外燈照射，每隔2、4、6、8、16、24、48 h取樣，將取出的樣品配制成1.5×108個·mL-1濃度的懸浮液。選取室內培養的健壯一致的分蘗期水稻苗，洗凈，剪成10 cm長的帶根稻莖，晾至表面無水痕，待用；將準備好的稻苗植株在配制好的溶液中浸漬30 s，取出晾干，用脫脂棉包住根部保濕，置于大號試管中；每個試管挑取20頭三齡期二化螟幼蟲，管口用黑色棉布罩住。每處理設4個重復，并設空白對照。處理后的試蟲置于溫度為(25±1)℃、相對濕度為70%～80%、光照周期為L∶D為16 h∶8h條件下飼養和觀察，72 h后檢查二化螟幼蟲的死亡率。

1.5 改性后的伴孢晶體蛋白防治二化螟田間試驗效果

試驗于2018年7月在浙江溫嶺市植保站試驗基地進行。將改性覆膜后的Bt伴孢晶體制成油懸浮劑進行田間藥效試驗，在二化螟1～2齡幼蟲發生高峰期，以常用的化學殺蟲劑氯蟲苯甲酰胺和市售Bt可濕性粉劑作為對照藥劑，清水為空白處理，采用無人機飛防噴霧法進行。調查藥后21 d的防治效果、采用五點取樣法，每點調查10叢水稻，統計10叢水稻內總枯心株數，同時全田調查50叢分蘗數，計算枯心率、防治效果。

1.6 數據分析

利用Excel 2010與DPS數據處理系統軟件對試驗數據進行統計，并以單因素的新復極差法對結果進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)

SEM與TEM觀察改性覆膜前后的Bt伴孢晶體結果如圖1所示，其中A1、A2分別為覆膜改性前后Bt伴孢晶體的SEM，B1、B2分別為硬脂酸改性覆膜前后的Bt伴孢晶體的TEM。從SEM圖片中可以看出，改性前的Bt伴孢晶體蛋白表面較平滑，結構致密，晶角及各棱邊平滑尖銳；改性后的Bt伴孢晶體蛋白的表面比較粗糙，晶角及棱邊鈍化，變得圓潤，晶體表面呈連續波浪狀。通過TEM照片可以看出，其表面均勻的包覆了一層厚度約40～60 nm的包覆層(圖B2箭頭所示)。

A1、A2分別為覆膜改性前后Bt伴孢晶體的SEM，B1、B2分別為硬脂酸改性覆膜前后的Bt伴孢晶體的TEM。圖1 Bt伴孢晶體改性前后的SEM及TEM

2.2 紫外線照射改性覆膜前后的Bt伴孢晶體對二化螟幼蟲的室內毒力測定

從圖2可以看出，覆膜改性前的Bt伴孢晶體蛋白在經紫外線照射2 h后，對二化螟幼蟲的毒力明顯下降，死亡率僅為60%。紫外線照射5 h后，殺蟲活性下降超過50%；照射24 h后，僅剩20%的死亡率。而覆膜改性后的Bt伴孢晶體蛋白，在紫外線照射24 h后，二化螟幼蟲仍有70%的死亡率。

圖2 紫外線照射改性覆膜前后的Bt伴孢晶體對二化螟幼蟲的毒力比較

2.3 改性后的Bt伴孢晶體蛋白防治二化螟田間試驗效果

由表1可見，改性后的Bt晶體108·mL-1油懸浮劑，667 m2用量100 mL處理對二化螟的防效為76.6%，明顯優于市售32 000 IU·g-1Bt可濕性粉劑100 g，與化學藥劑20%氯蟲苯甲酰胺懸浮劑20 mL處理的效果接近，二者無顯著性差異。

表1 改性后Bt伴孢晶體蛋白防治田間 二化螟的殺蟲效果

注：同列數據后無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 小結與討論

粉體表面改性是應現代高技術、新材料產業，特別是功能材料產業發展而興起的新技術，對提高無機粉體的應用性能和價值起著至關重要的作用[10]。目前粉體改性技術主要集中在對無機粉體領域，少見對有機材料或生物材料改性的報道。本研究首次利用粉體表面改性技術，以硬脂酸為改性劑，對Bt伴孢晶體進行表面覆膜改性處理。結果表明，硬脂酸能夠在Bt伴孢晶體上形成均勻的硬脂酸膜，厚度約20～40 nm。Bt伴孢晶體在紫外線的照射下，殺蟲活性迅速下降，僅2 h就下降28%，照射24 h后，相比對照只剩下24%的毒性；而覆膜改性后的Bt伴孢晶體，在紫外線照射24 h后仍保持76%的殺蟲活性，說明Bt伴孢晶體上覆的這層硬脂酸膜能有效阻隔紫外線對晶體蛋白的穿透及活性的影響，從而延長了Bt伴孢晶體蛋白的防效及持效性。田間藥效試驗結果進一步表明，與市售32 000 IU·g-1Bt可濕性粉劑相比，改性后的Bt伴孢晶體對二化螟的殺蟲效果明顯提高，與常用的化學殺蟲劑氯蟲苯甲酰胺的防效接近。同時，這種改性覆膜工藝操作簡單方便，高效，具有廣泛的應用前景。