西瓜炭疽病菌離體葉片接種鑒定技術

孫玉燕，范敏，何艷軍

(浙江省農業科學院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

西瓜(Citrulluslanatus)隸屬葫蘆科西瓜屬植物，我國目前西瓜的年栽培面積約為187萬hm2，總產量約為7 900萬t，居世界首位，其中浙江省西瓜年栽培面積約為7萬hm2，總產量約為215萬t[1]。西瓜炭疽病(Colletotrichumlagenerium)是由瓜類炭疽病菌引起的一種世界性病害，在保護地及露地栽培中均可發病，特別是在濕度較大的南方地區發病尤重，造成西瓜大量減產，甚至絕收。西瓜炭疽病在全生育期均可發病，葉片染病后，初為圓形或不規則形水漬狀斑點，后變褐色，出現同心輪紋；莖蔓染病，初始出現水漬狀黃褐色圓形或長橢圓形凹陷病斑，后變黑褐色，嚴重時導致莖蔓枯死；果實染病表現為水浸狀凹陷形褐色圓斑或長圓形斑，濕度大時病斑上產生粉紅色黏狀物[2-3]。目前防治西瓜炭疽病的主要方法包括選用抗病品種、對種子進行溫湯浸種或藥劑拌種、輪作、加強田間管理、控溫濕度、藥劑防治等措施，其中選育具有炭疽病抗性的西瓜品種是解決西瓜炭疽病的根本途徑。

西瓜抗病性鑒定篩選評價工作是抗病育種的重要環節。目前，西瓜炭疽病的抗性鑒定及評價方法有以下2種。1)苗期噴霧接種及分級評價法。將炭疽病菌配成孢子濃度為1×106的懸液，噴霧法接種于二葉期的無菌苗上，置于24～26 ℃、相對濕度95%～100%的黑暗條件下保濕48 h后給予正常光照，7～10 d后觀察發病情況[4-5]。參考劉莉等[6]的方法將西瓜幼苗對炭疽病的抗性分為0、1、3、5、7、9等6個等級。2)離體葉接種和AD評價法。配置孢子濃度為1×106的菌液，利用注射器懸滴接種葉齡為15～20 d的離體葉片，接種后第6天調查發病情況。抗病鑒定利用平均病斑直徑和病情指數進行評價[7]。此外，西瓜炭疽病的接種方法還包括涂抹法及點滴法[6]。

本研究利用點滴法對西瓜離體葉片進行炭疽病接種鑒定，并利用病斑直徑及發病率對西瓜種質材料進行抗病性鑒定評價。與活體接種鑒定相比，離體葉片接種鑒定具有不損傷植株、節省菌液、接種標準一致、不產生病原菌擴散等優點，可為西瓜炭疽病的抗性鑒定及篩選評價提供新的技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用病菌為長嶺西瓜炭疽病菌，由浙江大學生物技術研究所宋鳳鳴教授團隊提供。接種材料為浙江省農科院蔬菜所西瓜研究室提供的12份西瓜種質材料，分別為Charleston Gray、Navajo Sweet、PI288317、PI279460、PI368509、PI536457、PI278038、Sun sweet、Ford hook、鄭州2號、冬瓜皮、慶久。將這些材料的種子在55 ℃溫水浸種后，在室溫下浸泡3～4 h，用濕潤毛巾包裹好，放入28 ℃恒溫箱中催芽36 h，待種子萌芽后播入育苗穴盤中，育苗基質由草炭和蛭石按3∶1的比例配置而成。每份材料9株，待第4片真葉完全展開時準備進行接種。

1.2 炭疽病菌培養取樣及離體葉片處理

PDA液體培養基配置。200 g新鮮馬鈴薯去皮后切成小塊，煮沸30 min，2層紗布過濾去除殘余，在濾液中加入20 g葡萄糖，蒸餾水定容至1 000 mL，于121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，備用。

炭疽病菌培養。將保存的長嶺西瓜炭疽病菌轉接到PDA液體培養基中，將其在溫度為28 ℃、轉速為200 rpm的搖床上避光搖3 d，使其產生大量的孢子，將含孢子的PDA液體培養基用2層無菌紗布過濾，除去菌絲以獲取孢子懸浮液，利用血球計數板在顯微鏡下將孢子懸浮液的濃度調整為1×106mL-1，用于接種鑒定。

離體葉片處理。利用剪刀剪取植株第4片完全展開的真葉，以75%酒精表面消毒后，用無菌水沖洗，用吸水紙吸干表面水分，切口用封口膜封好，備用。

1.3 炭疽病菌接種離體葉片

在透明塑料盒底層放入吸水紙，并加入無菌水使其濕潤，將準備好的離體葉片置于吸水紙上。用微量移液器在葉片表面點滴10 μL長嶺西瓜炭疽病菌孢子懸浮液，每個葉片根據不同大小接種3～5個點(圖1)，并用透明塑料蓋子密封。將塑料盒放在25 ℃、濕度90%的培養箱中，暗處理48 h后給予正常光照，選擇無菌PDA接種為對照，每份種質處理9個葉片，5 d后調查發病情況。

圖1 點滴法對西瓜離體葉片接種長嶺西瓜炭疽病菌

1.4 數據統計及分析

抗性鑒定指標有平均病斑直徑及發病率。病害調查時，用電子游標卡尺測量每個接種點病斑的最大長度和最大寬度，記作縱徑和橫徑。病斑直徑為所有接種點病斑橫徑和縱徑的平均值。根據病斑直徑[7]對材料的炭疽病抗性進行劃分：0 mm，免疫；<0.50 mm，高抗；0.51～1.50 mm，抗病；1.51～2.00 mm，中抗；2.01～3.00 mm，感病；>3.01 mm，高感。

另外調查葉片發病率，即發病點占總接種點的百分比。用SAS和Excel軟件對抗性鑒定的指標即平均病斑直徑和發病率數據進行整理統計。

2 結果與分析

2.1 長嶺西瓜炭疽病菌觀察及發病癥狀表現

將長嶺西瓜炭疽病菌接種到PDA固體培養基中，生長至第10天，菌落顏色由中心至邊緣變為深灰色，邊緣波狀，出現同心輪紋。顯微鏡下顯示分生孢子為無色，單孢為卵圓或長圓形，具有隔膜。西瓜葉片接種長嶺西瓜炭疽病菌后，出現長橢圓形或不規則形的褐色同心輪紋(圖2)。

圖2 長嶺西瓜炭疽病菌的菌落表型、孢子形態及發病癥狀

2.2 西瓜種質抗病性鑒定

采用點滴法對西瓜離體葉片進行炭疽病菌接種，5 d后調查發病結果。
圖3顯示，不同種質材料對長嶺西瓜炭疽病菌的抗性表現不同，有的種質材料對長嶺西瓜炭疽病菌表現為免疫，而有的材料在長嶺西瓜炭疽病菌侵染后整個葉片出現病斑。

圖3 點滴法篩選獲得不同抗性的西瓜種質材料

利用平均病斑直徑及發病率[7]對12份西瓜種質的炭疽病抗性進行評價(表1)。這12份西瓜種質材料的平均病斑直徑為0～13.79 mm，發病率為0～88.00%，抗性存在較大差異。其中獲得對長嶺西瓜炭疽病菌免疫的材料1份(PI368509)，病斑直徑為0 mm，發病率為0；抗病材料1份(PI278038)，病斑直徑為0.71 mm，發病率為17.50%；中抗材料1份(Sun sweet)，病斑直徑為1.94 mm，發病率為25.00%。此外，對長嶺西瓜炭疽病菌表現為感病的材料1份(鄭州2號)，病斑直徑為2.07 mm，發病率為18.18%；對長嶺西瓜炭疽病菌表現為高感的種質材料為8份，包括Charleston Gray、Navajo Sweet、PI288317、PI279460、PI536457、Ford hook、冬瓜皮、慶久，病斑面積為3.88～13.79 mm，發病率為30.33%～88.00%。

表1 離體葉片接種長嶺西瓜炭疽病抗性鑒定結果

此外，對平均病斑直徑及發病率的相關性進行分析發現，二者相關系數達0.88，說明平均病斑直徑與發病率為顯著正相關。上述結果表明，結合點滴法進行離體葉片鑒定技術及利用平均病斑直徑和發病率的抗性評價體系，可以篩選出抗性不同的種質材料，為西瓜炭疽病的抗性遺傳改良奠定基礎。

3 小結與討論

浙江省處于亞熱帶地區，常年高溫、多雨、濕度較大，極易導致西瓜炭疽病的暴發與流行。目前生產上防治西瓜炭疽病主要依賴藥劑防治，對西瓜的質量安全及生態環境安全影響較大，同時也導致病原菌產生抗藥性，造成藥劑過量的惡性循環。因此，篩選抗病材料、選育抗病品種是目前西瓜炭疽病生產上亟待解決的問題。

建立可靠的人工接種方法是西瓜炭疽病抗性鑒定與評價的前提。目前，針對西瓜炭疽病的接種及評價方法主要有活體植株噴霧鑒定及分級評價法[4、6]、離體葉片接種鑒定及AD評價法[7]。本研究取西瓜植株完全展開的第四片真葉，配置孢子濃度為1×106mL-1的懸浮液，利用微量移液器在每個接種點接種10 μL的長嶺西瓜炭疽病菌孢子液，每個葉片根據大小接種3～5個點，在溫度 25 ℃，濕度為90%的光照培養箱中保持黑暗48 h后給予正常的光照，5 d后調查發病情況，利用平均病斑直徑及發病率進行鑒定評價，可以較好的區分不同西瓜種質材料對長嶺西瓜炭疽病的抗性表現。利用該接種方法，共篩選獲得西瓜炭疽病免疫材料1份(PI368509)、抗病材料1份(PI278038)、中抗材料1份(Sun sweet)(表1)，可為選育抗病、優質的西瓜品種提供材料基礎。

相比活體噴霧法[4、6]，本研究方法具有不損傷植株、節省菌液、不會產生病原菌擴散的優點；與文生倉等[7]所報道的利用微量注射器的懸滴法相比，該研究方法具有接種標準一致(即每個接種點接種10 μL的孢子懸浮液)，可定量進行鑒定評價的優點。此外，本研究對平均病斑直徑和發病率進行相關性分析，發現兩者的相關系數達到0.88，呈顯著正相關，說明利用平均病斑直徑和發病率進行離體葉片抗性鑒定評價是可靠的。綜上，西瓜離體接種鑒定方法(點滴法)可為西瓜炭疽病的抗性鑒定提供新的技術參考。