蟬花多糖提取工藝的優化

黃小忠，高大響，張雪松，宋剛，曾凡樂

(江蘇農林職業技術學院，江蘇 句容 212400)

蟬花(Cordycepscicadae)俗稱大蟬草，是一種被麥角菌科真菌感染寄生在幼蟬蟲體內形成的一種菌蟲復合體。擬青霉菌通過感染蟬幼蟲后[1]，寄生在蟲體內，將蟲體內的營養轉化成菌絲體，待到環境條件適合時，菌絲分化，從蟬的頭部形成子實體，且在子實體的頂端會長出具有繁殖功能的孢子。蟬花是我國傳統的藥用真菌之一，與冬蟲夏草有著相似的功效[2]。經醫學研究證明，蟬花具有降血糖及增強免疫力、降血壓、抗腫瘤、改善腎功能等作用[3]。

蟬花包括三個結構：菌殼、孢梗束、蟬花孢子。蟬花中的有效成分包括多球殼菌素、核苷類成分、麥角固醇及其過氧化物、環肽化合物、多糖、蟲草酸等，其中真菌多糖被廣泛應用到醫療方面。多糖的提取方法有水提法、微波法、超聲波輔助法、苯酚硫酸法、酶解法等[4]，水提法因其操作簡單、儀器設備要求不高、所需材料簡單而應用廣泛。本試驗通過對幾種提取條件的考察，優化多糖提取工藝，旨在為相關產品開發研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

蟬花菌種來自江蘇食用菌研究所。

1.2 方法

1.2.1 干燥蟬花菌體準備

將新鮮蟬花子實體用蒸餾水浸泡0.5 h，用軟毛刷將菌體上殘土去除，再用蒸餾水清洗5次，確保菌體無多余雜質。將瀝水后的蟬花菌體平放在鋪有干凈紙張瓷盤中，60 ℃烘箱中干燥至恒重[5]。

1.2.2 蟬花菌體的粉碎

干燥蟬花菌體經粉碎機粉碎5 min，用40目(孔徑0.42 mm)篩子過篩，棄雜質，再用60目(孔徑0.25 mm)篩子過篩。菌粉呈棕褐色，無雜質[6]。

1.2.3 料液比單因素試驗

取50 mL燒杯空杯稱重，然后加入2 g蟬花菌體粉，再分別加入25、20、15、10、5倍純水，用玻璃棒攪勻，用保鮮膜將燒杯封口并編號，于陰涼干燥的室溫下放置6 h，后放進超聲細胞破碎儀，調整好高度，破碎儀的探頭應在燒杯液體平面下1 cm。調整破碎儀的變幅桿選擇開關至Φ6，超聲5 s，間隔6 s，溫度60 ℃，時間30 min，取出燒杯。保鮮膜封口，60 ℃水浴1 h，將燒杯中的液體移至50 mL離心管，用10 mL純水洗凈殘渣至離心管，3 000 r·min-1離心5 min，膠頭滴管吸管吸取上清液。將收集好的上清液用旋轉蒸發儀60 ℃蒸發濃縮，收集濃縮液，加入4倍濃縮液體積的95%乙醇，保鮮膜封口后于4 ℃冰箱過夜。待多糖沉淀析出后，敞口將燒杯放進60 ℃的水浴鍋內揮發酒精，等燒杯中無明顯液體后，把燒杯放進60 ℃烘箱干燥4 h，以上每個樣品做3個平行樣。

1.2.4 預浸泡時間單因素試驗

取50 mL燒杯空杯稱重，然后加入2 g蟬花菌體粉，再各加入20倍的純水并攪勻，用保鮮膜將燒杯封口并編號，在陰涼干燥的室溫下分別進行3、4、5、6、7 h的預浸泡處理，其余操作同上，每個樣品做3個平行樣。

1.2.5 超聲時間單因素試驗

取50 mL燒杯空杯稱重，然后加入2 g蟬花菌體粉，再各加入20倍的純水攪勻，用保鮮膜將燒杯封口并編號，陰涼干燥的室溫下放置6 h。將燒杯放進超聲細胞破碎儀，調整好高度，破碎儀的探頭應在燒杯的液體平面下1 cm。調整破碎儀的變幅桿選擇開關至Φ6，60 ℃的條件下分別處理10、20、30、40、50 min。其余操作同上，每個樣品做3個平行樣。

1.2.6 標準曲線的制作

精密稱取適量的葡萄糖，加入純水定容配制成0.1 mg·mL-1的葡萄糖標準溶液。取7只試管，用吸量管準確吸取分別加入1.1、0.9、0.7、0.5、0.3、0.1、0 mL上述溶液，定容至2.0 mL，加入1.0 mL 6%苯酚溶液混勻，加5.0 mL濃硫酸，混勻靜置冷卻至室溫，沸水浴15 min，冷卻至室溫。分光光度計測定490 nm處的吸光值，縱坐標是測定的吸光值，橫坐標是葡萄糖標準品的質量濃度(mg·mL-1)，得到回歸方程y=0.194x+0.013 7，R2=0.990 3。

1.2.7 蟬花多糖提取

精密稱取適量的蟬花多糖，加入純水定容配制成0.2 mg·mL-1的多糖溶液，用吸量管準確吸取上述溶液0.5 mL加入到容量瓶中，加水定容至2.0 mL，測定條件參考標準曲線的做法[7-8]。將所得的蟬花多糖吸光值代入上述的回歸方程，計算出多糖質量濃度，計算蟬花多糖提取率。

1.2.8 正交試驗

由單因素試驗可得水浴時間、預浸泡時間、料液比、超聲時間等單因素的最適范圍，因水提時間單因素與標準曲線比較后顯示影響不大，所以正交試驗不再做水提時間的設計，選取水提1 h為標準操作時間。表1為設計的正交因素水平，選取預浸泡時間(A)、料液比(B)、超聲時間(C)3因素的最典型條件進行正交試驗。1～3水平A分別為5.5、6.0和6.5 h，B分別為15、20和25倍，C分別為35、40和45 min。

1.2.9 數據整理

菌粉稱取質量、燒杯空杯重量、稱取的蟬花多糖質量等精確至0.1/1 000，采用Excel 2010對蟬花多糖提取數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素

2.1.1 料液比

蟬花多糖的提取率受料液比影響明顯。從圖1可知，20倍的料液比的提取率最高，表示提取的蟬花多糖含量最高。

圖1 料液比倍數與提取率的關系

2.1.2 預浸泡時間

從圖2可知，提取率隨著預浸泡時間的增加而增大，到達一定時間后，提取率達到最大值，繼續增加浸泡時間，提取率隨之減小。6 h的預浸泡時間提取的蟬花多糖提取率最高。

圖2 預浸泡時間與提取率的關系

2.1.3 超聲時間

超聲時間對蟬花多糖的提取有明顯影響。從圖3可知，10和20 min超聲時間時的提取率較低，30 min超聲的提取率開始大幅增加，可見超聲時間對于蟬花多糖的提取率影響較大。結果表明，40 min超聲時提取率達到最大，隨后開始降低。

2.2 正交試驗

將正交試驗設計按照單因素的步驟操作試驗，得到的試驗結果如表1。

由表1可知，對于蟬花多糖提取率來說，超聲時間對其影響最大，其次是料液比因素，最后是預浸泡時間。通過正交試驗可得，最好的提取條件為45 min的超聲時間、20倍的料液比和6.5 h的預浸泡時間。

圖3 超聲時間與提取率的關系

組合號ABC提取率/%111115.2212218.3313327.6421220.2522325.2623117.8731328.1832125.3933220.2K161.263.558.3K268.268.858.7K373.665.681.0K120.421.219.4K221.122.919.6K324.521.927.0R4.11.87.6

2.3 各因子對蟬花多糖提取的影響

2.3.1 超聲時間

在45 min的超聲時間范圍內，蟬花多糖提取率達到最大值，這可能是因為超聲處理會使菌粉在溶液中產生空化破裂，提取劑進入菌粉細胞組織內部，使多糖可以更好的溶出。但隨著時間的推移，提取劑中的水溶性雜質濃度越來越高，提取劑中的傳質阻力越來越大，且破碎儀的工作效率很高，所具有的機械剪切能力很強，會導致多糖中的糖鏈斷裂，其多糖的藥理活性會受到影響。超聲時間太短不能充分裂解蟬花細胞，試驗表明，45 min左右的超聲時間為最佳。

2.3.2 預浸泡時間

蟬花粗多糖的提取率在一定范圍內會隨著預浸

泡時間的增加而增加，3 h的預浸泡時間的提取率較低，6 h預浸泡達到較大值，是前者的2倍之多，而6.5 h后提取率開始降低。隨著浸泡時間的增長，提取劑中多糖濃度增大，多糖的傳質作用變緩。預浸泡時間太短，多糖不能充分溶解，因此，浸泡時間不宜過長或過短，6.5 h左右最適宜。

2.3.3 料液比

隨著提取劑量的增大，蟬花粗多糖的提取率也隨著升高，達最大提取率時，料液比是1∶20，之后隨著料液比增加，提取率不再增加。如果提取劑比例太小，溶劑不能使菌粉充分浸透，提取率則降低，蟬花粗多糖不能完全被浸泡出來。而溶劑過多，會導致提取濃度過低。試驗表明，20倍的料液比是最適比例。

3 小結與討論

通過正交試驗表明，各因素對蟬花多糖提取率的影響程度為超聲時間>預浸泡時間>料液比，最優提取條件為45 min超聲時間、20倍料液比、6.5 h預浸泡時間，提取率達27.0%。優化多糖提取工藝，打破傳統提取方法，探索更好的提取條件，使提取工藝更加方便、快捷、環保，從而提升蟬花開發的價值，該研究為蟬花多糖提取開發提供參考。