CASS反應器中反硝化除磷污泥的微生物群落結構

王崢嶸 李建民 薛念濤 董志英

摘要 為深入了解CASS系統內的反硝化除磷污泥微生物群落結構，對反應器內初始接種污泥和馴化成功的污泥進行高通量測序分析，測序結果顯示CASS系統反硝化除磷污泥中富集了一定比例的、具有脫氮除磷能力的菌群，優勢菌群主要有變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和擬桿菌門（Bacteroidetes）。目水平上鞘脂桿菌目（Sphingobacteriales）和紅環菌目（Rhodocyclales）豐度增長較大，科水平上紅環菌科（Rhodocyclaceae）的豐度增長最大，可能包含具有反硝化功能的菌群。此分析結果也顯示出CASS系統具有一定的脫氮除磷功能。

關鍵詞 反硝化除磷污泥;CASS反應器;高通量測序;微生物菌群

中圖分類號 X703.1文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）14-0071-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.14.023

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Microbial Community Structure of Denitrifying Phosphorus Removal Sludge in CASS Reactor

Abstract To further understand the microbial community structure of denitrifying phosphorus removal sludge in CASS system，high throughput sequencing analysis was carried out for initial inoculation sludge and domesticated sludge.The results of high throughput sequencing showed that a certain proportion of bacteria with nitrogen and phosphorus removal ability were enriched in the sludge of denitrifying phosphorus removal in CASS system，and the dominant bacteria were mainly Proteobacteria，Chloroflexi and Bacteroidetes.Sphingobacteriales and Rhodocyclales increased the more abundances at the order level，Rhodocyclaceae increased the most abundances at the family level，possibly including denitrifying bacteria.The results also showed that the CASS system had a certain function of nitrogen and phosphorus removal.

Key words Denitrifying phosphorus removal sludge;CASS reactor;High throughput sequencing;Microbiology community

作者簡介 王崢嶸（1994—），女，江蘇鹽城人，碩士研究生，研究方向：水污染控制。*通信作者，研究員，碩士生導師，從事水污染控制研究。

收稿日期 2019-03-04

污水處理系統中，微生物群落多樣性與系統穩定性成正比，豐富的微生物種群有利于抵抗沖擊負荷和維護系統穩定運行。少數優勢菌群主導的微生物群落可能穩定性不足，但富含重要的功能菌群。呂小梅[1]對反硝化除磷污泥與傳統好氧除磷污泥的菌群結構與主導除磷微生物的差異性進行比較，認為好氧除磷污泥多樣性高于反硝化除磷污泥，2種污泥的核心功能菌群不同，在馴化過程中，好氧除磷污泥菌群結構僅有微小波動，而反硝化除磷污泥的菌群結構發生了明顯變化，也有其他研究得到了一致的結論[2]。周康群等[3]采用SBR富集反硝化聚磷菌，發現DNPAOs濃度增加為原來的57倍，富集后菌種種類減少且更加集中，主要為假單胞菌屬、棒狀桿菌屬、腸桿菌科和葡萄球菌屬。

生物分類基本單元為界、門、綱、目、科、屬、種，種為基本單元，微生物分類學可以用于初步判斷不同菌群的生物功能特征。對反硝化除磷污泥在門水平上的生物學研究較多，發現變形菌門（Proteobacteria）為反硝化除磷污泥主導菌群，對氮磷去除起著重要作用，馴化過程中下屬綱水平上α-、β-、δ-Proteobacteria有明顯變化[4]。目、屬水平更深入體現微生物群落結構差異，Acinetobacter是最早被鑒定為具有除磷作用的微生物[5]，在強化生物除磷系統除磷效果較好的穩定期內大量存在[6]，但吳昌永等[7]發現在A2O工藝反硝化除磷強化的過程中，Acinetobacter逐漸消失，認為Acinetobacter在反硝化除磷工藝中不占優勢。A/A反應器運行穩定期Xanthomonadales、Rhodocyclales、Burkholderiales為主導菌，Methylibium、Thauera為主導菌屬，系統中優勢菌群的變化也引起了系統功能的改變[8]。

目前很多報道的反硝化除磷菌屬都基于實驗室平板純培養分離的方式得到的結果，不能反映實際工藝中的微生物群落組成。該研究采用CASS工藝富集培養反硝化聚磷菌，反應器顯示出了良好的反硝化脫氮效果，出水COD、TP、TN、氨氮平均去除率超過90%，反硝化聚磷菌群成為系統優勢菌群[9]。為深入了解反硝化除磷污泥微生物群落結構多樣性的變化，探究DNPAOs主導菌群特點及功能，采用Illumina MiSeq高通量測序技術，以CASS富集培養反硝化聚磷菌前后活性污泥為對象，對反硝化聚磷菌群落組成進行微生物多樣性和分類學分析，以期進一步探索反硝化除磷污泥的微生物群落結構，為反硝化除磷技術的實際推廣應用提供理論支持。

為考察在脫氮除磷方面發揮主要作用的菌群組成，對2個樣品中豐度最大的菌群變形菌門在綱分類水平的分布特征進行進一步的分析，結果見表4。結果顯示，β-變形菌綱（βProteobacteria）的豐度在2個樣品中占比最大，分別為13.99%和19.83%。β-Proteobacteria菌群在脫氮除磷方面有著重要貢獻，吳昌永等[7]富集到了一種屬于βProteobacteria的新功能菌群Uncultured Chlorobibacterium;Ahn等[14]研究了DNPAOs的生物組成，SBR反應器中常見2種細菌Rhodoyclus和Dechlorimonas，屬于βProteobacteria。有2種菌種都屬于βProteobacteria，該菌群比例的提高證明了CASS系統對脫氮除磷菌群的富集能力。對比2個樣品，δ-變形菌綱（δProteobacteria）和γ-變形菌綱（γProteobacteria）的豐度均增加數倍，γProteobacteria可能包含具有反硝化脫氮能力以及除磷能力的菌群[15-16]，還未見有關于δ-變形菌綱（δProteobacteria）具有反硝化除磷性能的報道。

如圖5所示，在目分類水平上，1號樣品的主要菌群為紅色桿菌目（Rubrobacterales）、酸微菌目（Acidimicrobiales） 、芽單胞菌目（Gemmatimonadales）、紅螺菌目（Rhodospirillales）、伯克霍爾德氏菌目（Burkholderiales）和JG30-KF-CM45，2號樣品的主要菌群有鞘脂桿菌目（Sphingobacteriales）、紅環菌目（Rhodocyclales）、酸微菌目（Acidimicrobiales）、克霍爾德氏菌目（Burkholderiales）、黃色單胞菌目（Xanthomonadales）和粘球菌目（Myxococcales）。對比2個樣品菌群的變化情況發現，鞘脂桿菌目（Sphingobacteriales）的豐度由2.62%上升至10.97%，紅環菌目（Rhodocyclales）由不到1.00%上升至9.65%，可能包含具有反硝化功能的菌群[17-18]。此外，Bond等[19]研究表明，紅環菌目（Rhodocyclales）相關微生物是生物除磷系統的優勢聚磷菌。因此，從目的水平上微生物種群分析來看，CASS系統富集了具有脫氮除磷能力的物種，可能是反硝化聚磷菌。

在科分類水平上，1號污泥樣品和2號污泥樣品中微生物群落組成如圖6所示。其中，1號樣品主要包含Norank_O_JG30-KF-CM45、Elev-16S-1332、芽單胞菌科（Gemmatimonadaceae）、叢毛單胞菌科（Comamonadaceae）和酸微菌科（Acidimicrobiales），2號樣品主要包含紅環菌科（Rhodocyclaceae）、腐螺旋菌科（Saprospiraceae）和叢毛單胞菌科（Comamonadaceae）。Fahrbach等[20]從城市污水處理廠的活性污泥中分離得到一株革蘭氏陰性反硝化細菌Denitratisoma，是紅環菌科的一個新屬，具有好氧反硝化能力。對比樣品1和樣品2的菌群豐度變化，紅環菌科（Rhodocyclaceae）的豐度增長較大。紅環菌科（Rhodocyclaceae）是除磷系統的主要構成菌群，并且可能具有反硝化功能，紅環菌可能含有反硝化聚磷菌。

3 結論

與初始接種污泥相比，CASS系統中反硝化除磷污泥中富集了一定比例的具有脫氮除磷能力的菌群，優勢菌群主要有變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和擬桿菌門（Bacteroidetes），其中β-變形菌綱（β-Proteobacteria）的豐度占比較大。放線菌門相較初始接種污泥降幅明顯，證明了CASS有助于減少污泥膨脹的優勢。

鞘脂桿菌目（Sphingobacteriales）和紅環菌目（Rhodocyclales）豐度增長較大，可能包含具有反硝化功能的菌群。其中紅環菌科（Rhodocyclaceae）是除磷系統的主要構成菌群，并且可能具有反硝化功能，可推斷紅環菌含有反硝化聚磷菌。

參考文獻

[1] 呂小梅.反硝化除磷菌群結構與工藝調控策略[D].哈爾濱：哈爾濱工業大學，2014.

[2] 周俊.反硝化除磷顆粒污泥反應器快速啟動及其功能菌群作用機制研究[D].武漢：武漢大學，2016.

[3] 周康群，劉暉，孫彥富，等.反硝化聚磷菌的SBR反應器中微生物種群與濃度變化[J].中南大學學報（自然科學版），2008，39（4）：705-711.

[4] ZHANG T，SHAO M F，YE L.454 Pyrosequencing reveals bacterial diversity of activated sludge from 14 sewage treatment plants [J].The ISME Journal，2012，6（6）：1137-1147.

[5] FUHS G W，CHEN M.Microbiological basis of phosphate removed in the activated sludge process for the treatment of wastewater[J].Microbial ecology，1975，2（2）：119-138.

[6] 李偉光，田文德，康曉榮，等.強化生物除磷工藝微生物種群結構分析[J].化工學報，2011，62（12）：3532-3538.

[7] 吳昌永，彭永臻，王淑瑩，等.強化反硝化除磷對A2O工藝微生物種群變化的影響[J].化工學報，2010，61（1）：186-191.

[8] 熊付娟.反硝化除磷污泥除磷脫氮特性及菌群結構研究[D].哈爾濱：哈爾濱工業大學，2013.

[9] 劉康，薛念濤，李建民，等.CASS反應器內反硝化聚磷菌處理生活污水的性能[J].環境工程學報，2018，12（9）：2483-2489.

[10] 聞韻，王曉慧，林常青.Miseq測序分析活性污泥系統中細菌群落的動態變化[J].環境工程學報，2015，9（11）：5225-5230.

[11] CHANG Y M，YANG Q，HAO C B，et al.Experimental study of autotrophic denitrification bacteria through bioaugmentation of activated sludge from municipal wastewater plant [J].Environmental science，2011，32（4）：1210-1216.

[12] CAROLINE K，CATERINA L，ARJAN B，et al.Identity abundance and ecophysiology of filamentous bacteria belonging to the Bacteroidetes present in activated sludge plants[J].Microbiology，2008，154（3）：886-894.

[13] 王亞超，南亞萍，袁林江，等.A2/O和SBR系統中微生物群落結構比較分析[J].工業微生物，2017（6）：25-30.

[14] AHN J，DAIDOU T，TSUNEDA S，et al.Characterization of denitrifying phosphate-accumulating organisms cultivated under different electron acceptor conditions using polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis assay[J].Water research，2002，36（2）：403-412.

[15] 金云霄.智能化控制SBBR處理城市污水脫氮除磷性能和微生物學研究[D].北京：中國地質大學，2011.

[16] 羅曉，鄭向陽，趙叢叢，等.A/O工藝中污泥濃度對微生物群落結構的影響[J].中國環境科學，2018，38（1）：275-283.

[17] 方芳，王淑梅，馮翠杰，等.好氧條件下復合生物膜-活性污泥反應器中的反硝化菌群結構[J].生態學雜志，2011，30（3）：430-437.

[18] 駱靈喜，劉歡，李旭寧，等.膜生物反應器異養硝化菌的篩選與硝化特性研究[J].科學技術與工程，2015，15（6）：132-135.

[19] BOND P L，ERHART R，WAGNER M，et al.Identification of some of the major groups of bacteria in efficient and nonefficient biological phosphorus removal activated sludge systems[J].Applied and environmental microbiology，1999，65（9）：4077-4084.

[20] FAHRBACH M，KUEVER J，MEINKE R，et al.Denitratisoma oestradiolicum gen.nov.，sp.nov.，a 17β-oestradiol-degrading，denitrifying betaproteobacterium[J].International journal of systermatic and evolutionary microbiology，2006，56（7）：1547-1552.