咸豐鲊廣椒中乳酸菌的分離與鑒定及其泡菜發酵特性評價

鄧風，張一涵，羅芳會，趙慧君，郭壯，張振東

（湖北文理學院食品科學技術學院，湖北 襄陽 441053）

泡菜是一種傳統發酵食品，可以多種蔬菜為主要原料，經過發酵制成。因其操作簡單，風味獨特，品種多樣，且具有良好的口感而深受大眾的喜愛。在我國，主要以四川泡菜最為出名，其產品銷量位居全國第一。據不完全統計，2009年四川泡菜產量就已經達到了120 萬噸，產值90 億元[1]。有研究表明，泡菜中存在著多種乳酸菌，如植物乳桿菌、腸膜狀明株桿菌和短乳桿菌等[2]。乳酸菌不僅是泡菜發酵中最主要的菌群，還是其獨特風味品質的良好來源[3]。

但傳統的泡菜制作工藝由于發酵周期長，容易產生較多雜菌的原因會導致其在風味、口感等品質上變差，而通過人工接種菌劑的方式可以增強泡菜中特定乳酸菌的發酵優勢，抑制其他雜菌的生長，增強泡菜品質。于是，可以篩選發酵能力優良的乳酸菌，如植物乳桿菌、干酪乳桿菌[4]、戊糖片球菌、腸膜狀明串珠菌[5]等用于泡菜的發酵制作。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）作為一種常見的乳酸菌，它不僅可以幫助調節人體腸道微生物，對于降低膽固醇也有十分重要的意義[6]。因此在眾多的食品生產中應用廣泛，尤其以發酵食品的生產最為突出，如泡菜[7]、米酒[8]、醬油[9]、酸奶[10]、食醋[11]等。鲊廣椒是一種經過自然發酵的調味品，研究表明鲊廣椒中蘊含了豐富的乳酸菌資源[12]。因此，本研究從恩施州咸豐地區采集自然發酵的鲊廣椒樣品，使用傳統可培養法，對鲊廣椒中的乳酸菌進行了分離、純化與鑒定，并使用所分離到的乳酸菌發酵制作泡菜，對泡菜水進行品質評價，以期為發酵蔬菜產業提供候選菌株支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豇豆、食鹽：襄陽市襄城區鑫源超市；泡菜壇子：淄博海沃家具專營店；石蕊牛乳培養液：湖北文理學院食品科學技術學院實驗室自制；MRS 培養基 [蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、瓊脂（均為生物試劑）、乙酸鈉、檸檬酸二胺、磷酸氫二鉀、葡萄糖（均為分析純）]、甘油，氯化鈉，磷酸，磷酸二氫鉀：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；鲊廣椒樣品：從恩施州咸豐地區農戶家中采集了5 份不同來源的鲊廣椒樣品，裝入無菌樣品瓶，并使用樣品箱迅速帶回實驗室。

1.2 主要儀器

LRH-150 生化培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；LXJ-IIB 型低速大容量多管離心機：上海安亭科學儀器廠；SA402B 味覺分析系統（該系統包含AAE、CTO、CAO、COO、AEI 等 5 個測試傳感器，2 個參比傳感器）：日本 Insent 公司；PEN3 電子鼻：德國 Airsense公司；LC202ADXR高效液相色譜儀：日本島津公司；KH-100DY 超聲波清洗機：昆山禾創超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離及純化

從采集到的5 份恩施州咸豐地區鲊廣椒中進行乳酸菌的分離：首先取樣品2 g 加入到15 mL 無菌的石蕊牛乳培養基中，37 ℃培養48 h，然后用生理鹽水將石蕊牛乳培養液稀釋至梯度為10-5、10-6和10-7，涂布到含有1%碳酸鈣的MRS 培養基中，置于厭氧工作站中37 ℃培養2 d。根據菌落的形態特征，挑選產生透明圈的菌株，進行革蘭氏染色與過氧化氫酶試驗[13]。將具有透明圈、革蘭氏陽性且過氧化氫酶陰性的菌作為待定的乳酸菌在MRS 平板上進行連續劃線分離純化，將純化后的菌株使用30%的甘油于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.3.2 乳酸菌的鑒定

具體方法參照王丹丹等[14]的方法。即將純化后的乳酸菌接入MRS 培養基中收集菌體，進行菌株DNA的提取，然后以提取的DNA 為模板應用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術，將擴增后得到的產物連接載體和克隆進行基因組的測序，將測序后獲得的乳酸菌166S rRNA 序列在NCBI 的GenBank中進行Blast 比對，選取同源性較高的菌作為模式菌株，構建乳酸菌分離菌株系統發育樹，確定所分立的乳酸菌的系統分類地位。

1.3.3 泡菜的制作方法

泡菜制作的工藝流程：豇豆→清洗→瀝干→裝壇→加入鹽水→接種→發酵→產品檢測。具體操作為，菌種的準備：將分離并鑒定的乳酸菌使用MRS 液體培養基連續活化3 代，并使用生理鹽水重懸。配制鹽水：按照每升水稱取40 g 食鹽的比例溶解、煮沸、冷卻晾涼；選材：豇豆無蟲蛀，硬度好；裝壇：稱取豇豆250 g，切成5 cm 小段，裝入壇中，再加入晾涼的鹽水635.5 mL；接種：按照1%[15]添加量接入所分離的乳酸菌；發酵：將裝壇并接種了乳酸菌的壇子在25 ℃條件下放置7 d。

1.3.4 泡菜水的電子鼻測定

具體方法參考楊成聰等[16]的方法，即首先量取15 mL 泡菜水樣品裝于樣品瓶中，55 ℃水浴保溫10 min 后，室溫25 ℃下靜置10 min，然后插入電子鼻探頭進行頂空進樣測試（注意避免樣品沾到瓶蓋）。電子鼻金屬氧化電極測定時，在45 s 左右達到穩定，為避免測試誤差，本研究選取49、50 s 和51 s 時的平均值作為數據分析。檢測條件：清洗時間150 s，探頭插入時間5 s，自動調零時間5 s，進樣流速120 mL/min，內部流量120 mL/min。

1.3.5 電子舌的測定

183＊＊＊＊8081：黃昏里，古巷中，老樹下。老人機，發短信，求上墻。期中考，心好慌，求小意，上個墻。

樣品的準備：首先分別量取150 mL 泡菜水樣品，常溫下10 000 g 離心5 min，然后收取上清液，再量取60 mL 上清液用無菌水稀釋至一倍備用。樣品檢測：當電子舌系統進行傳感器自檢和診斷后，將經處理后的樣品倒入樣品測試杯中，然后參照Kobayashi 等[17]的方法進行操作，對不同樣品的酸味、苦味、澀味、咸味、鮮味、后味A（澀味的回味）以及后味B（苦味的回味）7 個不同滋味進行檢測分析。

1.3.6 泡菜水有機酸的測定

流動相的配制：配制0.01 mol/L 磷酸二氫鉀的溶液，調節pH 值至2.3，進行抽濾，然后超聲5 min 后備用。樣品的前處理：吸取2 mL 的泡菜水到10 mL 容量瓶中，加入 200 μL 的 0.1 mol/mL 的磷酸溶液，加流動相至10 mL。將已處理好的樣品溶液過0.22 μm 濾膜，取1 mL 裝入樣品瓶中進行測定。測定條件：使用反向C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）進行檢測，檢測器波長為 215 nm，流速為 1 mL/min，進樣量為 20 μL，柱溫為30 ℃。

1.3.7 數據分析

使用SPSS Statistics 17.0 的Kruskal-Wallis 對不同泡菜水樣品進行顯著性分析，作圖均使用origin 8.5進行。

2 結果與討論

2.1 乳酸菌的分離與鑒定

圖1 部分乳酸菌分離菌株形態Fig.1 The morphology of the lactic acid bacteria isolates

將得到的20 株乳酸菌提取基因組DNA，并通過PCR 與測序，獲得它們的16S rRNA 序列后，在Gen－Bank 數據庫進行BLAST 比對，比對結果顯示這些菌株的序列均與植物乳酸桿菌（Lactobacillus plantarum）、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）及類植物乳桿菌（Lactobacillus paraplantarum）的模式菌的16S rRNA 序列之間的相似度均達到99%以上。從NCBI 數據庫提取相似度較高的模式菌的16S rRNA 基因序列，使用MEGA7.0[18]構建系統發育樹進行系統發育分析，結果見圖2。

由圖2可知，所分離的乳酸菌與植物乳酸桿菌、戊糖乳桿菌與類植物乳桿菌模式菌聚在同一分支上。有研究認為可以通過多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）法將植物乳桿菌分成不同的類型[19]，因此本研究通過16S rRNA 基因序列分析尚無法將植物乳桿菌群的乳酸菌鑒定到種，只能將所分離到的20 株乳酸菌鑒定為植物乳桿菌群（Lactobacillus plantarum-group）[20]。

圖2 基于16S rRNA 基因序列的乳酸菌分離菌株系統發育樹Fig.2 The phylogenetic tree of lactic acid bacteria isolates based on 16S rRNA gene sequence analysis

2.2 發酵不同泡菜揮發性風味的分析

電子鼻是一個模仿生物嗅覺的系統，能夠對大多數揮發性成分的氣體進行分析和檢測，主要由三部分組成：氣體流量系統、傳感器組和分析控制軟件。其中傳感器組是由10 個金屬氧化氣體傳感器組成，分別為W1C、W5S、W3C、W6S、W5C、W1S、W1W、W2S、W2W、W3S。不同的傳感器能夠對不同種類的氣味物質做出響應，并且不受到主觀因素的影響，因此可以用來對食品的氣味做出客觀的評價。表1為不同種類的傳感器對應性能描述。

表1 電子鼻的傳感器性能描述Table 1 Description of sensor performance of electronic nose

使用電子鼻對泡菜水中各風味物質進行檢測分析，把測定的數據繪制成箱形圖，見圖3。

圖3 添加不同乳酸菌發酵的泡菜水風味指標的箱形圖Fig.3 Box map of various flavor indexes of pickle water fermented with different lactic acid bacteria isolates

由圖3可知，本研究中添加了20 株植物乳桿菌發酵制作的不同泡菜水樣品間的傳感器W1S 及W1W和W2S 的差異性最大，極差值分別為15.19、12.91 和9.63，即所分離的植物乳桿菌對泡菜水中的甲烷、有機硫化物、萜類物質以及乙醇等風味物質有較大的作用，且不同的乳酸菌之間，作用差異較大（p＜0.05）。使用傳感器 W1C、W3C、W5C、W3S 與 W6S 對不同泡菜水樣品測定的響應值不存在顯著差異，即樣品間的氨氣、芳香味、烷烴與氫氣類氣味物質差異不明顯。在泡菜的制作過程中，風味物質僅僅是影響泡菜品質的一個方面。為了進一步研究添加植物乳桿菌對泡菜品質的影響，本研究將以不同泡菜水樣品測得的滋味指標做了進一步的分析。

2.3 植物乳桿菌對泡菜水滋味的影響

泡菜的口感是泡菜品質的重要體現，一般來說，酸辣可口，同時苦澀味較少的泡菜的品質較好。為確定分離到的乳酸菌的泡菜發酵特性，采用電子舌技術對泡菜水樣品的滋味指標進行了評價，結果見圖4。

圖4 添加不同乳酸菌發酵的泡菜水各滋味指標雷達圖Fig.4 Radar map of the taste indices of pickles fermented with lactic acid bacteria isolates

由圖4可知，接種了所分離乳酸菌發酵的泡菜水樣品的咸味、鮮味和豐度與對照組相比，差異不顯著。與未接菌對照處理相比，接種了乳酸菌HBUAS51135、HBUAS51141、HBUAS51146、HBUAS51153、HBUAS -51155、HBUAS51156、HBUAS51157 與 HBUAS51162的泡菜水樣品的苦味與澀味無顯著差異，而后味A 與后味B 均顯著低于對照組（p＜0.05）；同時，接種了乳酸菌HBUAS51135、HBUAS51141、HBUAS51146、HBUAS -51153、HBUAS51155、HBUAS51156 與 HBUAS51157的泡菜水樣品的酸味顯著高于未接菌處理（p＜0.05），具有酸爽的滋味，同時苦味與澀味及它們的回味也較低，因此可以用來進一步篩選，用作泡菜發酵劑開發的候選菌株。

2.4 泡菜水樣品的有機酸分析

乳酸菌可以代謝糖類產生乳酸，形成泡菜的酸爽口感，為進一步說明泡菜水樣品酸味產生的原因，使用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定了泡菜水樣品的有機酸組成。通過HPLC 系統，檢測到泡菜水樣品中的有機酸包括6 種，分別是酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸，具體結果見圖5。

圖5 添加不同乳酸菌發酵的泡菜水中有機酸含量Fig.5 The organic acids content in pickle water fermented with different lactic acid bacteria isolates

由圖5，與其他有機酸相比，泡菜水樣品中乳酸最高含量為4.34g/L～10.81g/L，添加了乳酸菌HBUAS51131、HBUAS51134、HBUAS51136、HBUAS51141、HBUA S-51146、HBUAS51149、HBUAS51150、HBUAS51152、HBUAS51155、HBUAS51156、HBUAS51160、HBUAS -51161 和HBUASS51162 的泡菜水中乳酸含量顯著高于對照組，其中添加了乳酸菌HBUAS51131、HBUAS-51134、HBUAS51136、HBUAS51141、HBUAS 51150、HBUAS51155 和HBUAS51156 的泡菜水中乳酸含量高達9.20 g/L。乳酸主要由乳酸菌產生，酸味更加溫和，表明這幾株菌的產乳酸能力較強，除了能為泡菜的發酵營造一個酸性環境，從而抑制一些其他不耐酸的微生物活動，加快發酵的速度，縮短發酵周期外[21]，也能賦予泡菜的更加柔和的滋味。相反，乙酸的酸味則較為刺激[22]，從圖5中也可以看出乳酸含量高的泡菜水樣品的乙酸含量較少，因此乳酸含量較高的菌株，更適用于泡菜發酵劑菌株的開發。結合電子舌的滋味測定結果，乳酸菌HBUAS51141 和HBUAS51156 作為發酵劑制作的泡菜，苦澀味較輕，同時乳酸含量較高，因此更適于用作泡菜復合發酵劑開發的候選菌株。

3 結論

從湖北恩施州咸豐地區采集的5 份鲊廣椒樣品中共分離得到了20 株乳酸菌，均鑒定為植物乳桿菌。使用所分離到的乳酸菌進行了豇豆泡菜的發酵制作，并對豇豆泡菜水品質進行了品質評價，結果顯示使用乳酸菌HBUAS51141 和HBUAS51156 發酵的泡菜水中乳酸含量高達9.20 g/L 以上，同時苦澀味較輕，是豇豆泡菜復合發酵劑開發的優良候選菌株。