濃縮果汁中游離糖的組成分析

李開，曾鳴，宋昊，王冬

（1.北京一輕研究院，北京 101111；2.北京市食品工業研究所，北京 100075）

糖類在植物體的結構和功能方面起著非常重要的作用，不僅是植物生長過程中的能量來源和物質基礎，還是糖代謝和基因表達過程中通過糖感知系統調節酶促反應的信號[1-2]。糖類是食品中的主要營養物質，同時對食品的風味、甜味、質構和穩定性有一定的影響，其種類和含量直接影響食品的營養價值。最近幾年，我國果汁飲料加工業發展迅速，已經成為了全球最大的濃縮果汁生產國和出口國，濃縮果汁的品質控制顯得尤其重要。糖類是濃縮果汁的主要成分，糖類的組成成分影響著濃縮果汁的甜味，同時糖類也是濃縮果汁中可溶性固形物的重要組成[3]，所以監測濃縮果汁中糖類的組成對產品質量的控制有著重要意義。

目前國內外對糖含量的分析方法包括化學法和儀器分析法，化學法有直接滴定法、高錳酸鉀滴定法、鐵氰化鉀法、奧氏試劑滴定法測定食品中的還原糖[4]和總糖，雖然化學法相對便宜、準確度高，但是耗時長、效率低、無法準確定性糖的種類。儀器分析法包括分光光度法[5]、毛細管電泳法（capillary electroph-oresis，CE）[6-7]和色譜法，分光光度法和化學法一樣不能確定糖的種類；糖類既不帶電，也沒有紫外吸收和熒光特性，使用CE 檢測糖類化合物需要讓糖帶電或者衍生化，技術要求較高，操作耗時長，結果重現性較差；色譜法種類較多，主要有離子交換色譜法[8-9]（ion exchange chromatography，IEC）、氣相色譜法[10-11]（gas chromatography，GC）和高效液相色譜法[12-14]（high performance liquid chromatography，HPLC），IEC 靈敏度高，但是糖類在電極表面發生氧化還原反應會導致穩定性不夠好，另外設備昂貴；糖類化合物沸點高、難揮發、難氣化和熱穩定差，不能直接用GC 進行分析，需要對樣品進行衍生化處理、需用有毒試劑、操作比較復雜、穩定性差[15]；相比之下，HPLC 具有簡便、準確、樣品前處理容易等優勢，因此成為了食品中糖分離鑒定、定量分析的主要手段。由于糖類在紫外可見光區無吸收以及無熒光特性，將二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD）和熒光檢測器（fluorescence detector，FLD）應用于糖類的檢測需要將糖進行衍生化處理[16-17]，這就使分析流程變得復雜，降低了其通用性；相比其他檢測器，蒸發光散射檢測器（evaporative light-scattering detector，ELSD）和示差折光檢測器（differential refraction detector，RID）在糖類的分析中應用得最廣[18]，雖然ELSD 相對于RID 靈敏度更高、基線更穩定，但是ELSD 更昂貴、操作更復雜，所以在滿足定性定量的基本前提下，日常生產過程中糖的檢測分析使用RID 更具優勢。

本文采用HPLC-RID，建立了快速、準確地分離分析木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖的方法，為濃縮果汁中游離糖的檢測、監管提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

配備 G1311C 泵、G1329B 進樣器、G1316A 柱溫箱和G1362A 示差折光檢測器的1260 高效液相色譜系統：安捷倫科技有限公司；HF-2000R 高速離心機：上海利鑫堅離心機有限公司；HC-C18萃取小柱（4.6 mm×12.5 mm，5 μm）：上海安譜實驗科技股份有限公司。

濃縮桔汁、濃縮橙汁：南充佳美食品工業有限公司；濃縮蘋果汁：天水長城果汁集團有限公司；乙腈（色譜純）：上海安譜實驗科技股份有限公司；木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖（含量≥99%）：Sigma-Aldrich LLC.；超純水（電阻率為 18.2 MΩ·cm）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX Carbohydrate Analysis Column（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相為 75 ∶25 的乙腈-水；流速為 1.3 mL/min；柱溫為 35 ℃；RID 溫度為 35 ℃；進樣量為 5 μL。

1.2.2 樣品前處理

稱取樣品2 g～5 g，用超純水溶解，定容至50 mL，然后10 000 r/min 離心20 min，取上清液備用。為了除去樣品中可能影響到目標物分析的諸如有機酸、色素等雜質，本文將樣品溶液經過C18萃取小柱進行凈化處理，首先將C18萃取小柱先用2 mL 甲醇活化，然后用2 mL 超純水沖洗以去除甲醇，取5 mL 離心后的上清液至萃取小柱，棄去開始的2 mL 流分，收集后續溶液，用孔徑為0.45 μm 的濾膜過濾，濾液待分析。

2 結果與分析

2.1 標準物質色譜峰的確定

按照1.2.1 的色譜條件，測定6 種糖的混合標準溶液，得到如圖1所示的色譜圖，然后分別測定每種糖的標準溶液，確定每種糖的保留時間，最終得到各組分的出峰順序為木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖。

圖1 糖標準品的色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of the sugar standards

2.2 色譜條件的優化

2.2.1 流動相比例的選擇

改變流動相乙腈和水的比例，其他條件不變（流速為1.0 mL/min，為了保持RID 狀態穩定，柱溫與RID溫度一致為 30 ℃）。分別考察在乙腈/水為 70 ∶30、75 ∶25、80 ∶20 時對6 種糖的分離效果的影響，得到的色譜圖如圖2所示。

隨著乙腈的濃度增大，分離度逐漸增大，但是保留時間也逐漸增大，峰寬逐漸加大；流動相比例為70 ∶30 時，果糖和葡萄糖沒有完全分離，峰形較差，隨著乙腈比例的增大，分離效果變好，75 ∶25 時完全分離，并且峰形都較好，如果繼續增大乙腈的比例，峰的展寬加重且分離時間變長。綜合分離時間與分離度，選擇75 ∶25 為流動相比例。

2.2.2 測試溫度的選擇

柱溫是色譜分析的一個重要參數，直接影響化合物的分離度和分析速度。為了考察柱溫對分離6 種糖的影響，保持流動相比例（乙腈∶水=75 ∶25）、流速（1.0 mL/min）不變，控制分析溫度為 25、30、35、40 ℃，分離結果如圖3所示。

圖2 不同流動相比例時糖標準溶液的色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of the sugar standards in different volume ratios of the mobile phases

圖3 不同分析溫度時糖標準溶液的色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of the sugar standards analyzed in different temperatures

隨著溫度的升高，各化合物的保留時間逐漸變短，但是分離度和保留時間變化都不是太明顯，綜合考慮選擇35 ℃為分析溫度。

2.2.3 流速的選擇

根據van Deemter 速率理論方程式H=A+B/u+Cu（A、B、C 為常數，H 為理論塔板高度，u 為流動相線速度），在一定范圍內，隨著流速的降低，H 降低、柱效升高、分離度變大，但是流速過低時，分析時間變長、柱效反而降低；提高流速可以縮短分離時間，但是流速過高時，待分析化合物來不及分離就被洗脫出，柱效就會降低，分離效果變差。保持流動相比例（乙腈∶水=75 ∶25）、溫度（35 ℃）不變，考察流速為 1.0、1.3、1.5 mL/min 時6 種糖的分離情況，如圖4所示。

圖4 不同流速時糖標準溶液的色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of the sugar standards analyzed on different flow rates of the mobile phase

在3 種流速下，6 種糖的分離效果都較好，隨著流速的升高，分析時間顯著縮短。另外，流速升高增大，柱壓會隨之升高，會影響色譜柱壽命，從1.3 mL/min 到1.5 mL/min 分析時間差別較小，所以最終確定1.3 mL/min為流動相速度。

2.3 樣品前處理

濃縮果汁的組成非常復雜，含有糖類、色素、酚類和有機酸類等化合物，色素、酚類和有機酸類化合物的疏水性比糖類化合物強，容易吸附在色譜柱上不被洗脫，長期這樣會降低色譜柱的柱效，縮短色譜柱的壽命，所以正式分析前應對樣品進行凈化處理。HCC18萃取小柱的填料具有較高的疏水性，糖類化合物在柱子上很難保留，而色素等干擾物質相較于待測化合物的疏水性強、在柱子上保留強，從而可以凈化樣品溶液。濃縮蘋果汁樣品凈化前后的對比效果見圖5，經固相萃取后色素去除完全，待測化合物的峰形、峰面積沒有影響，柱壓明顯降低，說明該方法能簡單快速凈化果汁待測樣品。

圖5 樣品處理前后的效果Fig.5 The results before and after treatment of samples

2.4 方法的驗證

配制6 種糖的一系列濃度標準溶液，按照優化過的分析條件進樣測試，同一濃度分析3 次，對峰面積（y）和濃度（x）進行擬合，得到6 種糖的線性方程和相關性系數（如表1所示），線性范圍較寬，R2＞0.999 0。

表1 方法的線性方程Table 1 Linear equations of six sugars

為了研究方法的重現性，按優化后的色譜條件，將6 mg/mL 的標準溶液連續進樣6 次，分別計算每種化合物保留時間（tR）和峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），結果見表2，tR的 RSD 為0.05%～0.07%，峰面積的RSD 為0.77%～4.54%；另外，為了研究方法的穩定性，連續6 d 對6 mg/mL 的混合標準溶液測試，分別計算每種化合物的tR和峰面積的 RSD，結果見表2，tR的 RSD 為 0.41%～1.75%，峰面積的RSD 為1.39%～2.99%。以上結果說明方法重現性良好并具有較好的穩定性，這可能是由于糖溶液比較穩定、在不同日期檢測其含量波動較小[19]。

表2 精密度試驗結果（n=6）Table 2 Results of the precision experiments（n=6）

為了檢驗方法的準確度，以濃縮蘋果汁為基質進行加標回收試驗，向濃縮蘋果汁中加入24.575 mg/g 和48.750 mg/g 的混合標樣，然后根據優化后的條件進行測試，平行分析3 次，結果見表3。

6 種糖的回收率在87.20%～105.22%，證明該方法準確性較好。通過以上線性范圍、精密度和回收率結果可知，該方法準確可靠，能滿足濃縮果汁中糖類定性定量分析的要求，可以用于濃縮果汁品質的控制。

2.5 實際樣品測定

采用優化后的條件對3 種濃縮果汁進行分析，根據保留時間對樣品的色譜峰進行定性，色譜圖見圖6。測定結果見表4，濃縮蘋果汁、濃縮桔汁和濃縮橙汁中都只檢出果糖、葡萄糖和蔗糖。其中，濃縮蘋果汁中，果糖含量＞葡萄糖含量＞蔗糖含量；而濃縮桔汁和濃縮橙汁中蔗糖含量＞果糖含量＞葡萄糖含量，柑橘汁中葡萄糖與果糖的含量比值基本上保持在0.85 與1 之間，這個指標可以作為識別濃縮柑橘汁的真偽[3，20]，本文中被測濃縮桔汁和濃縮橙汁這個指標分別為0.95 和0.90。

表3 濃縮蘋果汁中糖的加標回收率（n=3）Table 3 Spiked recoveries of the six sugars in the concentrated apple juice（n=3）

圖6 濃縮果汁的液相色譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of the concentrated juices

表4 3 種濃縮果汁中糖含量的測定結果（n=3）Table 4 Contents of sugars in three concentrated juices（n=3）

3 結論

本文建立了HPLC-RID 同時分離分析木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖的方法，同時將該方法應用到了濃縮果汁中游離糖的組分分析中。結果表明，本方法前處理簡單，具有較寬的線性范圍，精密度、準確度和穩定性良好，結果可靠，對濃縮果汁生產加工品質監控以及濃縮果汁原料真偽鑒別具有重要的應用價值。