貴州傳統(tǒng)自然發(fā)酵牛干巴中風(fēng)味品質(zhì)與細(xì)菌群落多樣性分析

劉涵玉，何臘平，2，*，李翠芹，陳翠翠，鄭佳，朱秋勁，2，陶菡，2

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

牛干巴屬于干腌牛肉這一大類產(chǎn)品，是我國(guó)云貴川特色臘牛肉制品，具有風(fēng)味獨(dú)特、味道鮮美、食而不膩等特點(diǎn)[1]。風(fēng)味決定了消費(fèi)者對(duì)產(chǎn)品的可接受程度。不同地區(qū)的牛干巴因其加工工藝、制作原料、氣候等因素的不同，形成了不同的風(fēng)味特征。已有學(xué)者對(duì)云南、新疆等地的牛干巴揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行研究[2-3]。沙坤等[2]指出云南黃牛和牦牛干巴分別由50 種和42種揮發(fā)性風(fēng)味成分，并且確定了新疆不同地區(qū)的風(fēng)干牛肉樣品特征性香氣成分：己烷、2-戊基-呋喃、1-辛烯-3-醇和部分醛類。Kaban 等[4]報(bào)道了土耳其干腌牛肉中檢測(cè)出48 種揮發(fā)性風(fēng)味成分，芳樟烴類是含量最豐富的化合物。但針對(duì)貴州牛干巴研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此有必要對(duì)貴州牛干巴揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行研究。

目前對(duì)牛干巴菌群結(jié)構(gòu)的研究還是最傳統(tǒng)的分離方法，由于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的局限性，使其不能全面真實(shí)反應(yīng)牛干巴中微生物的群落組成。因此有必要采用當(dāng)前較先進(jìn)成熟，價(jià)格適當(dāng)?shù)膇llumina MiSeq 第二代高通量測(cè)序平臺(tái)。

本試驗(yàn)以貴州市售牛干巴為材料，采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)其揮發(fā)性成分進(jìn)行分析并結(jié)合主成分分析，找到貴州牛干巴的風(fēng)味成分的組成，同時(shí)結(jié)合illumina MiSeq 第二代高通量測(cè)序平臺(tái)，評(píng)估牛干巴中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性；在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析牛干巴中風(fēng)味品質(zhì)與細(xì)菌群落多樣性之間的關(guān)系，為牛干巴產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)評(píng)價(jià)，加深對(duì)牛干巴發(fā)酵機(jī)制的認(rèn)識(shí)，以及生產(chǎn)工藝的優(yōu)化提供科學(xué)依據(jù)。

1 方法與材料

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)所用3 組貴州干巴（真空包裝）購(gòu)于貴州興義農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，樣品編號(hào)分別為：牛干巴1、2、3 號(hào)。樣品購(gòu)買(mǎi)后切分成小塊，真空包裝，并儲(chǔ)存于于-80 ℃冷凍冰箱中備用。

正構(gòu)烷烴（色譜純）：北京百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-7000B 氣-質(zhì)聯(lián)用儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司；DB-WAX 型色譜柱（250 μm × 0.25 μm，30 m）：美國(guó) J＆W Scientific 公司；固相微萃取裝置（50/30 μm CAR/DVB/PDMS 固相微萃取頭）：美國(guó)Supelco 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 感官評(píng)定

感官評(píng)定參照高月娥等[5]的方法。由10 位專家組成的評(píng)價(jià)小組分別從色澤、口感、氣味、滋味和組織狀態(tài)5 個(gè)方面對(duì)牛干巴進(jìn)行感官分析。

1.3.2 揮發(fā)性風(fēng)味成分的測(cè)定

頂空固相微萃取條件：稱取3 g 肉樣切碎成肉末，放入20 mL 萃取瓶，密封，50℃條件下平衡20 min。插入50/30 μm CAR/DVB/PDMS 固相微萃取頭進(jìn)行吸附40 min。轉(zhuǎn)移插入氣相色譜質(zhì)譜儀（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）進(jìn)樣口，在 250 ℃溫度下解析7 min，同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)。

氣譜條件：毛細(xì)管柱為DB-WAX 柱（250 μm×0.25 μm，30 m），程序升溫：起始溫度 40 ℃，保持 3 min；然后5 ℃/min 的速度升溫到150 ℃，保持1 min；再以3 ℃/min 的速度升溫到200 ℃，保持1 min；最后以5 ℃/min 的速度升溫到230 ℃，保持3 min。氣化室溫度250 ℃；載氣為 N2，流速 6 mL/min，分流比 5 ∶1。

質(zhì)譜條件：電子電離源，電子能量70 eV，接口溫度250 ℃，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度150 ℃，傳輸線溫度280 ℃。

定性定量分析：對(duì)總離子流圖中的各峰采用Nist2005 和Wiley275 普庫(kù)檢索，取匹配度70 %以上，初步確定牛干巴的揮發(fā)性成分，再結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)系列烷烴（C7～C40）在相同氣質(zhì)條件下，根據(jù)保留時(shí)間，分別計(jì)算不同物質(zhì)的保留指數(shù)（retention indices，RI），再結(jié)合網(wǎng)站www.odour.org.uk 上的RI 值進(jìn)行化合物的鑒定。計(jì)算公式如下：

式中：TR（x）為待測(cè)組分保留時(shí)間，min；TR（z+1）為碳數(shù)為Z、Z+1 正構(gòu)烷的保留時(shí)間，min；且TR（z）

定量分析：采用峰面積歸一化法確定各化學(xué)成分的相對(duì)含量。

主成分分析：對(duì)3 種牛干巴樣品相對(duì)含量大于0.05 的揮發(fā)性成分借助SPSS 20.0 進(jìn)行主成分析。

1.3.3 高通量測(cè)序

3 種牛干巴樣品送北京百邁克生物科技有限公司，提取DNA 后，進(jìn)行擴(kuò)增細(xì)菌16S V3-V4 區(qū)并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行處理形成測(cè)序文庫(kù)，質(zhì)檢合格后，可用Illumina HiSeq 2500 進(jìn)行測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0 軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（Duncan 法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評(píng)價(jià)

貴州牛干巴感官評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 貴州牛干巴感官評(píng)價(jià)得分Table 1 Sensory evaluation score of Guizhou Niuganba

1 號(hào)和3 號(hào)牛干巴色澤最好，切面呈玫瑰紅，有光澤，感官評(píng)分顯著高于 2 號(hào)牛干巴（P＜0.05），2 號(hào)牛干巴切面脂肪偏黃，色澤深暗，并且口感方面較為綿軟，咀嚼缺乏韌勁，因此口感感官評(píng)分也較低。但是2 號(hào)牛干巴氣味、滋味和組織形態(tài)得分均高于1 號(hào)和3 號(hào)牛干巴（P＜0.05），擁有牛干巴專有香氣，氣味濃郁，香味純正，整體風(fēng)味比例恰當(dāng)，切面均勻光滑，組織紋理清晰。而1 號(hào)和2 號(hào)牛干巴中辛香料味道過(guò)重，掩蓋了原本牛干巴的特有香氣，整體風(fēng)味不協(xié)調(diào)。

2.2 貴州牛干巴揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)研究

貴州牛干巴揮發(fā)性風(fēng)味成分的定性和定量分析結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 貴州牛干巴揮發(fā)性風(fēng)味成分的定性和定量分析Table 2 Qualitative and quantitative analyses of volatile compounds detected in Guizhou Niuganba

續(xù)表2 貴州牛干巴揮發(fā)性風(fēng)味成分的定性和定量分析Continue table 2 Qualitative and quantitative analyses of volatile compounds detected in Guizhou Niuganba

續(xù)表2 貴州牛干巴揮發(fā)性風(fēng)味成分的定性和定量分析Continue table 2 Qualitative and quantitative analyses of volatile compounds detected in Guizhou Niuganba

烴類是3 組牛干巴中檢測(cè)種類最多的化學(xué)類別，共有 25 種，1 號(hào)牛干巴有 17 種（7.62%），2 號(hào)牛干巴11 種（50.8%），3 號(hào)牛干巴（12.62%）。烯烴類化合物種類相對(duì)較多，原因可能與加入的辛香料有關(guān)。這類烯烴氣味強(qiáng)烈，閾值較低[6]，對(duì)貴州牛干巴的風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)。如α-姜黃烯則存在于干姜等植物中[7]氣味濃郁芳香。辛香料物質(zhì)香氣柔和，風(fēng)味醇香，可同其他揮發(fā)性成分一起賦予牛干巴清香獨(dú)特的風(fēng)味[8]。可見(jiàn)辛香料添加的種類和含量對(duì)貴州牛干巴揮發(fā)性風(fēng)味成分有比較大的影響。

本試驗(yàn)共鑒定出14 種醛類化合物，它是牛肉主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。1 號(hào)牛干巴含有12 種醛類（3.7%），3號(hào)牛干巴含有6 種2.46%），2 號(hào)牛干巴含有4 種，雖然數(shù)量最少，但是含量都高于另外兩組。醛類主要來(lái)自于脂肪氧化和斯特雷克爾（strecker）氨基酸反應(yīng)[9]。這些醛類當(dāng)中，直鏈脂肪醛、烯醛是典型的脂肪氧化的產(chǎn)物[10]，檢測(cè)到的戊醛、己醛、（E）-2-庚烯醛可能源于不飽和脂肪酸的氧化作用[11]。而氨基酸的strecker 降解可以形成支鏈醛，如苯甲醛、苯乙醛等[12-13]。醛類由于香氣閾值一般較低，且具有薄荷味[14]、清香和油脂香氣味特征，對(duì)干腌肉制品的風(fēng)味形成有重要貢獻(xiàn)，是肉類風(fēng)味品質(zhì)的重要評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)之一[15]，常被認(rèn)為對(duì)不同種肉的特征香氣有貢獻(xiàn)[16-17]。

醇類一般來(lái)源于微生物代謝（苯乙醇等支鏈醇）、脂肪氧化或者是羰基化合物還原生成，還有一部分來(lái)自辛香料中[18]，比如，桉葉油醇、芳樟醇、4-松油烯醇。此外，3 組牛干巴中均檢測(cè)出芳樟醇，1 號(hào)和3 號(hào)樣品中的含量分別高達(dá)75.72%和75.84%，是含量最高的揮發(fā)性風(fēng)味成分，但2 號(hào)含量只有15.93 1%，而這1、3號(hào)感官得分相近，說(shuō)明芳樟醇對(duì)1、3 貴州牛干巴的風(fēng)味成分具有較大貢獻(xiàn)。

鑒定醇酮類5 種，在3 組牛干巴中均含有乙偶姻、花椒素，除乙偶姻來(lái)源于美拉德反應(yīng)中糖降解反應(yīng)外，其他4 種均來(lái)源于辛香料的添加。

另外還檢測(cè)出6 種其他類化合物。3 種牛干巴中均檢測(cè)出乙酸乙酯、乙酸和2，3，5，6-四甲基吡嗪，乳酸菌通過(guò)糖代謝生成乙酰磷酸，在乙酸激酶作用下可產(chǎn)生乙酸[19]。而微生物的酯化作用，可以使羧酸與醇類反應(yīng)生成酯類，酯類化合物對(duì)于食品風(fēng)味的貢獻(xiàn)很大。3 組樣品中檢測(cè)到了乙酸乙酯和丁酸芳樟酯。具有特殊香味的雜環(huán)化合物和硫醚類化合物，分別來(lái)源于美拉德反應(yīng)和硫醇類化合物反應(yīng)[20]。

通過(guò)這3 組貴州牛干巴樣品的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行分析，與其他地區(qū)牛干巴產(chǎn)品比較，發(fā)現(xiàn)其揮發(fā)性成分在種類與含量組成方面是有差異的。W?sierska等[21]，Kaban 等[4]發(fā)現(xiàn)，微生物代謝作用也會(huì)形成干腌牛肉風(fēng)味，例如：3-甲基-1-丁醇，乙酸乙酯，己酸乙酯等。然而通過(guò)分析貴州牛干巴風(fēng)味物質(zhì)的來(lái)源，推測(cè)可知，辛香料的添加、氨基酸的strecker 反應(yīng)、脂肪氧化和微生物代謝作用是形成貴州牛干巴獨(dú)特風(fēng)味物質(zhì)的重要途徑。其風(fēng)味成分以萜烯類、醇類和醛類為主，其中烴類物質(zhì)種類最多，醇類物質(zhì)含量最高（除2號(hào)樣品）。這樣的成分組成明顯區(qū)別于其他地區(qū)牛干巴：伊犁風(fēng)干牛肉以酚類物質(zhì)為主，其次是烴類和醇類；塔城風(fēng)干牛肉中，則是醛類物質(zhì)含量最高，再以醇類和烴類為其次風(fēng)味物質(zhì)；在阿勒泰風(fēng)干牛肉中，烴類物質(zhì)含量高于醛類和醇類物質(zhì)[22]。云南牦牛干巴的風(fēng)味組成中含量最高的是烴類，而醛類則是黃牛干巴的組成中含量最高的風(fēng)味成分[2]。其中阿勒泰牛干巴與云南牦牛干巴中的烴類物質(zhì)主要是長(zhǎng)鏈脂肪烴與含苯芳香烴類，這類烴類物質(zhì)主要來(lái)源于原料肉中動(dòng)物飼料的沉淀，區(qū)別于貴州牛干巴中主要來(lái)源于香辛料的烯萜類物質(zhì)。

對(duì)比國(guó)外的干腌牛肉制品，土耳其Pastirma 由于加工周期（1 個(gè)月左右）比較短，鑒定的揮發(fā)性化合物種類較少，總共有48 種揮發(fā)性成分被鑒定，而芳香烴類（甲苯）是成品中最豐富的成分。W?sierska 等[21]的研究發(fā)現(xiàn)：不同部位的牛肉制成的干腌牛肉的揮發(fā)性成分的組成是不同的，而脂肪氧化和微生物代謝是形成風(fēng)味物質(zhì)的主要途徑。通過(guò)對(duì)比國(guó)內(nèi)外干腌牛肉制品可知：原料肉的性質(zhì)差異、加工工藝的不同及配料使用的不同可能是導(dǎo)致各類產(chǎn)品風(fēng)味組成差異的原因。

貴州牛干巴制作歷時(shí)約1 個(gè)月。較長(zhǎng)的制作周期，給了脂肪足夠的時(shí)間氧化分解，形成了多種醛類，同時(shí)氨基酸的strecker 降解或微生物的代謝產(chǎn)生了醇類和其余風(fēng)味物質(zhì)，但通過(guò)感官評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，沒(méi)有感受到明顯油脂香氣。而花椒、五香調(diào)料等辛香料，也就是烴類物質(zhì)風(fēng)味較為明顯。出現(xiàn)這樣的情況是因?yàn)橘F州地區(qū)天氣潮濕，肉制品易腐敗變質(zhì)。傳統(tǒng)牛干巴中大量使用辛香料，可以達(dá)到抑菌、延長(zhǎng)保質(zhì)期的效果，同時(shí)這也導(dǎo)致牛干巴中辛香料風(fēng)味過(guò)重，掩蓋了其余風(fēng)味，造成整體風(fēng)味不協(xié)調(diào)，缺乏牛肉香味的情況。

2.3 主成分分析

為了進(jìn)一步直觀反映出不同牛干巴與其揮發(fā)性物質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)性，對(duì)相對(duì)含量大于0.5 的揮發(fā)性代謝物進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 牛干巴風(fēng)味成分主成分分析的得分散點(diǎn)圖和因子載荷圖Fig.1 Score and corresponding loadings plots rom principal component analysis of volatile aroma compounds

主成分1 的方差貢獻(xiàn)率為65.5%，主成分2 的貢獻(xiàn)率為34.4%，二者累計(jì)貢獻(xiàn)率已覆蓋風(fēng)味品質(zhì)信息。主成分 1 與（V48）1-甲基-4-（1-甲基乙烯基）環(huán)己醇、（V47）芳樟醇、（V58）崖柏酮、（V55）芐醇、（V27）己醛等風(fēng)味物質(zhì)高度正相關(guān)，乙酸乙酯（V62）、2，3，5，6-四甲基吡嗪（V64）、二烯丙基二硫（V65）與主成分 2 高度正相關(guān)。說(shuō)明1-甲基-4-（1-甲基乙烯基）環(huán)己醇、芳樟醇、崖柏酮、芐醇、己醛、乙酸乙酯等化合物是貴州牛干巴揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的主要特征化合物。由圖1a 可知，3 種牛干巴樣品根據(jù)其發(fā)性風(fēng)味成分明顯分為3個(gè)區(qū)域，并且相距都比較遠(yuǎn)，說(shuō)明差異大，但1、3 號(hào)感官評(píng)分卻相近，這說(shuō)明雖然差異大但也可得到類似的感官評(píng)分效果，不過(guò)其主體風(fēng)味肯定不同。而且1、3 號(hào)風(fēng)味成分都顯著多于2 號(hào)，但感官評(píng)分低于2 號(hào)，這說(shuō)明不能僅靠添加更多的香辛料來(lái)提升牛干巴品質(zhì)。改進(jìn)牛干巴品質(zhì)除了添加適當(dāng)協(xié)調(diào)的香辛料外，還得通過(guò)改進(jìn)其它工藝條件來(lái)完成。

圖1b 為香氣物質(zhì)載荷圖，載荷系數(shù)反映了牛干巴中各揮發(fā)性化合物對(duì)各主成分的影響。牛干巴1 號(hào)在第一象限，正十三烷（V21）、癸醛（V34）、花椒素（V61）、乙酸乙酯（V62）對(duì)其影響顯著，為其特征性成分，牛干巴 2 號(hào)在第三象限，與烴類（己烷（V1）、辛烷（V2）等）和順-香葦醇（V54）、花椒素（V61）高度正相關(guān)，為其特征性成分，牛干巴3 號(hào)在第四象限，與反-β-羅勒烯（V17）、3-甲基十一烷（V10）、α-松油烯（V11）、芐醇（V55）、α-松油醇（V51）等化合物呈正相關(guān)。綜上所述，不同牛干巴與揮發(fā)性物質(zhì)之間的相關(guān)性主要集中在來(lái)源于辛香料的烴類和醇類化合物。

2.4 不同牛干巴中細(xì)菌群落多樣性分析

2.4.1 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

為了得到有效數(shù)據(jù)，對(duì)下機(jī)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，相關(guān)質(zhì)量分析及統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示。

表2 原始數(shù)據(jù)與有效數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 2 The original data and effective statistics

由表2可以看到，對(duì)低質(zhì)量和無(wú)用序列進(jìn)行過(guò)濾后，3 個(gè)樣品的Q20 和Q30 堿基百分比有所提高，分別達(dá)到97%和99%以上，有效降低了Illumina 平臺(tái)測(cè)序的錯(cuò)誤率。

2.4.2 細(xì)菌群落的豐度分析

3 種貴州牛干巴的物種相對(duì)豐度分布（屬水平）如表3所示。

表3 貴州牛干巴優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌屬及其豐度Table 3 Abundance of predominant bacteria in samples Guizhou Niuganba

3 種牛干巴樣品中，在門(mén)水平上主要是軟壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、藍(lán)藻菌門(mén)、變形菌門(mén)、互養(yǎng)菌門(mén)、綠屈撓菌門(mén)、放線菌門(mén)、熱袍菌門(mén)、厚壁菌門(mén)等。3 種牛干巴所含物種基本相似，主要優(yōu)勢(shì)菌是變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)。進(jìn)一步對(duì)細(xì)菌群落中主要優(yōu)勢(shì)菌屬進(jìn)行分析。不同種類牛干巴中細(xì)菌菌屬結(jié)構(gòu)存在一定差異。在3 種牛干巴中，乳桿菌屬、葡萄球菌屬和嗜冷桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌，但比例差別較大；另外3 號(hào)牛干巴科貝特氏菌屬也為優(yōu)勢(shì)菌，這是貴州牛干巴特有的，其它地方牛干巴未見(jiàn)報(bào)道。不少學(xué)者對(duì)其他地區(qū)的牛干巴研究較多，肖蓉等[23]在牛干巴加工過(guò)程中，使用傳統(tǒng)分離篩選方法篩選到優(yōu)勢(shì)菌：埃希氏菌、微球菌、乳桿菌、假單胞菌和片球菌；呂彩霞[24]利用傳統(tǒng)分離篩選方法從云南牛干巴中篩選出4 株優(yōu)勢(shì)發(fā)酵菌，包括2 株肉糖葡萄球菌和2 株乳酸菌。劉姝韻等[25]利用變性梯度凝膠電泳技術(shù)對(duì)云南牛干巴加工過(guò)程中的細(xì)菌菌落多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)葡萄球菌屬、嗜冷桿菌及明串珠菌屬為優(yōu)勢(shì)菌種；此外，牛干巴加工過(guò)程中還存在著不可培養(yǎng)的菌群。以上研究結(jié)果均與本研究有相似之處，也就是乳酸菌、葡萄球菌和嗜冷桿菌屬都為牛干巴優(yōu)勢(shì)菌屬。尤其是乳酸菌和葡萄球菌的代謝作用分解蛋白質(zhì)為肽和氨基酸，不僅形成了大量風(fēng)味物質(zhì)，還對(duì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值做出貢獻(xiàn)。其次是嗜冷桿菌屬，牛干巴1 號(hào)和牛干巴3 號(hào)樣品中相對(duì)豐度較高，分別為12.77%和28.44%，遠(yuǎn)高于牛干巴1 號(hào)。嗜冷菌屬能夠分解脂類和水解蛋白質(zhì)，從而引起輕微腥味和發(fā)霉的氣味[26]。但更有不同之處：首先3 號(hào)牛干巴含有特有的優(yōu)勢(shì)菌科貝特氏菌屬，這在其它地方牛干巴未見(jiàn)報(bào)道；再者環(huán)絲菌屬、明串珠菌屬、沙雷菌屬、弧菌屬、假單胞菌的相對(duì)豐度都低于5.6%，其中，嗜冷桿菌、弧菌屬、假單胞菌屬等在諸多肉制品腐敗變質(zhì)過(guò)程中都被發(fā)現(xiàn)，它們被認(rèn)為會(huì)對(duì)肉制品的安全和品質(zhì)造成損害，所以貴州牛干巴安全性較好，這可能主要得益于香辛料對(duì)腐敗菌的抑制作用和氣候條件也有關(guān)系。

2.4.3 牛干巴聚類分析

牛干巴聚類分析結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 牛干巴聚類分析Fig.2 Similarity coefficient based dendrogram constructed among samples

由圖2可知，牛干巴1 號(hào)（NGB1）和牛干巴2 號(hào)（NGB2）距離最近，其微生物種類和數(shù)量最為相似，這可能與它們的工藝較為相似有關(guān)。通過(guò)上述各水平的分析以及微生物群落結(jié)構(gòu)的聚類分析已初步表明不同牛干巴的微生物群落結(jié)構(gòu)有較大差異：雖然貴州牛干巴與云南牛干巴都以葡萄球菌屬和乳桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌，但是貴州牛干巴同時(shí)也以魏斯氏菌和嗜冷桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌，具體的，其中牛干巴1 號(hào)優(yōu)勢(shì)菌為乳桿菌，2 號(hào)為葡萄球菌屬，3 號(hào)為嗜冷桿菌屬。而云南牛干巴還以明串珠菌屬菌為優(yōu)勢(shì)菌屬。

2.5 牛干巴揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與微生物的關(guān)系

3 種牛干巴樣品中的主要酸類物質(zhì)都是乙酸。作為優(yōu)勢(shì)微生物的乳酸菌（乳桿菌、魏斯氏菌等）對(duì)發(fā)酵肉制品風(fēng)味的貢獻(xiàn)，主要是通過(guò)分解代謝碳水化合物、氨基酸等產(chǎn)生有機(jī)酸。細(xì)菌對(duì)碳水化合物的代謝和脂質(zhì)氧化可產(chǎn)生并不斷積累醇類物質(zhì)，例如異型發(fā)酵的乳酸菌可產(chǎn)生乙醇，而苯乙醇等支鏈醇也可能是來(lái)源于微生物作用。有研究表明乳酸菌也會(huì)影響發(fā)酵香腸的脂肪氧化速率，脂肪氧化形成醛類、酮類物質(zhì)，對(duì)干腌肉制品風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)。所有牛干巴樣品中均含有乙酸乙酯，酯類物質(zhì)的形成主要與發(fā)酵相關(guān)。乳桿菌在牛干巴中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位，其代謝產(chǎn)物乙酸是形成乙酸乙酯及其他香味成分的重要物質(zhì)基礎(chǔ)；明串珠菌可利用碳水化合物進(jìn)行異型發(fā)酵產(chǎn)生乙酸，也可作為乙酸乙酯的前體物。

而且，3 種牛干巴雖然菌群豐富，但是由主成分分析知這3 種牛干巴的特征風(fēng)味成分基本上都不是微生物代謝產(chǎn)生的而是來(lái)源于香料成分，微生物發(fā)酵對(duì)風(fēng)味物質(zhì)有所貢獻(xiàn)但不突出，這從牛干巴1 號(hào)和牛干巴2 號(hào)的微生物種類和數(shù)量最為相似但其感官評(píng)分和風(fēng)味成分卻差別較大也能看出：微生物相似代謝物也應(yīng)類似，但感官評(píng)分差別較大，這也說(shuō)明微生物代謝產(chǎn)生的風(fēng)味在其中不占主要作用，這可能是添加過(guò)多的香辛料抑制了微生物的代謝發(fā)酵作用。因此，為發(fā)揮微生物發(fā)酵代謝的優(yōu)異性能，后續(xù)需要加以改進(jìn)發(fā)酵工藝。

3 結(jié)論

1）對(duì)貴州牛干巴進(jìn)行了揮發(fā)性風(fēng)味成分的種類與含量的分析。共檢測(cè)到67 種化合物，包括烴類（25）、醛類（14）、醇類（17）、酮類（5），其他類（6），其中共有成分有16 種。3 組牛干巴的揮發(fā)性風(fēng)味成分在種類和含量上有差異，原因可能是原料肉、腌制方法、制作工藝等因素的不同。根據(jù)主成分分析可知：豐富多樣的辛香料為其風(fēng)味做出了重要貢獻(xiàn)，但是過(guò)重的辛香料風(fēng)味覆蓋了牛干巴該有的肉香。

2）運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)采集的3 種傳統(tǒng)發(fā)酵牛干巴的細(xì)菌群落進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明傳統(tǒng)發(fā)酵牛干巴中細(xì)菌多樣性豐富，主要優(yōu)勢(shì)菌是變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)，而乳桿菌屬和葡萄球菌屬占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。不同種類牛干巴中細(xì)菌菌屬結(jié)構(gòu)存在一定差異，而且3 號(hào)牛干巴還存在科貝特氏菌屬優(yōu)勢(shì)菌，這是貴州牛干巴特有的。另外利用高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)存在部分不可培養(yǎng)菌種。

3）3 種牛干巴雖然菌群豐富，但是由多種分析知這3 種牛干巴的特征風(fēng)味成分基本上都不是微生物代謝產(chǎn)生的而是來(lái)源于香料成分，微生物發(fā)酵對(duì)風(fēng)味物質(zhì)有所貢獻(xiàn)但不突出，添加過(guò)多的香辛料抑制了微生物的代謝發(fā)酵作用。后續(xù)需要加以改進(jìn)發(fā)酵工藝發(fā)揮微生物發(fā)酵代謝的優(yōu)異性能。

4）對(duì)貴州牛干巴中揮發(fā)性風(fēng)味成分的形成過(guò)程還需進(jìn)一步研究：可探究其風(fēng)味形成途徑、風(fēng)味協(xié)調(diào)性與不可培養(yǎng)菌株的種類，為貴州牛干巴風(fēng)味品質(zhì)協(xié)調(diào)、生產(chǎn)工藝的調(diào)控、延長(zhǎng)保質(zhì)期等提供理論依據(jù)。開(kāi)展貴州牛干巴貨架期的研究，增強(qiáng)牛干巴的商業(yè)性推廣。