新基質曲釀造黑糯米酒工藝條件優化

母應春，姜麗，禹曉婷，蘇偉，母雨

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025）

黑糯米是水稻品種中的珍貴品種，被譽為“高原黑珍珠”[1-2]。黑糯米多屬粳型糯稻，其米皮呈烏黑或黑、紫黑、褐黑或棕黑，具有附著力極強的紫色素，對幾種急性心肌缺氧、缺血等有明顯保護作用。同時黑糯米有顯著的藥用功效，也稱為“藥米”，具有補中益氣、滋陰益腎、補胃暖肝、益精補肺、寒泄痢等功效[3-4]。有研究表明，米酒中含有大量的多酚、黃酮及多糖等物質，因為其較強的清除自由基和抗氧化等功能性作用[5-6]，其中的多酚類物質已經成為黃酒研究的熱點。

趙旭等[7]以糖化酶協同微生物釀造黑糯米酒，得到了較傳統工藝相比更高品質的黑糯米酒。齊琦等[8]以黑糯米為原料，釀制而成的酒精度低和糖分含量高的一種特色美酒。同時齊琦等[9]也以12 種藥食同源藥材，經過粉碎混合以后加入黑糯米酒中同時進行發酵，制成了黑糯米保健酒，具有補肝腎、健脾等作用。制曲添加中藥材由來已久[10]，本試驗將12 種藥食同源物質制成酒曲后用于黑糯米酒發酵，旨在抑制發酵體系中雜菌生長，還可以在微生物作用下使藥材中的有益物質充分釋放，豐富黑糯米酒中功能性成分含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑糯米：貴州省永紅酒業有限公司；新基質曲（以山藥、干姜、芡實、桑葚子、人參、枸杞、酸棗仁、牛蒡根、沙棘、覆盆子、瑪卡、甘草12 種物質制得）：奧淼中藥材；沒食子酸、福林酚試劑、碳酸鈉、乙醇（均為分析級）：貴州慕為美生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

L5S 紫外可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；UX220H 電子天平：廈門欣銳儀器儀表有限公司；DHP-420 型電熱恒溫培養箱：北京市永光明醫療儀器廠；HH6 電熱恒溫水浴鍋：天津泰斯特儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑糯米酒發酵工藝流程

選用無發霉、無蟲蛀及顆粒飽滿的黑糯米。將黑糯米浸泡至米粒帶有裂紋后蒸煮30 min，以涼白開淋米冷卻；加入以藥食同源物質所制得的酒曲進行發酵，將發酵后的酒液以4 000 r/min 離心30 min，澄清后以0.45 μm 的微孔膜過濾后進行灌裝。70 ℃條件下保溫15 min 進行滅菌。

1.3.2 單因素試驗

以總酚含量、感官評分為評價指標，分別考察發酵時間（4、5、6、7、8、9 d）、發酵溫度（24、28、30、34、37 ℃）、新基質曲添加量（6%、8%、10%、12%、15%、20%）、泡米時間（0、3、5、7、9 h）對黑糯米酒品質的影響。

1.3.3 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以（A）發酵時間、（B）發酵溫度、（C）新基質曲添加量、（D）泡米時間度為試驗因素，每個因素選擇3 個水平，以黑糯米酒的總酚含量、感官評分為評價指標，采用L9（34）正交設計確定黑糯米酒的最佳工藝參數，試驗因素與水平見表1。

表1 黑糯米酒發酵工藝優化試驗因素與水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation technology optimization of black glutinous rice wine

1.3.4 黑糯米酒感官方法

產品的感官評價參考文獻[11-12]和GB/T13662-2018《黃酒》：根據黑糯米酒的形態色澤、香氣香味、酒體滋味及風格為評分項目，由10 名專業人士組成的品評小組進行綜合感官評價后進行打分，滿分為100 分，感官評分標準如表2所示。

表2 黑糯米保健酒感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standards of black glutinous rice wine

1.3.5 總酚含量的測定

采用Folin-Ciocalteu 比色法[13]測定總酚含量。

1.3.6 數據處理

采用Origin 9.0 和IBM SPSS Statistics 25 進行圖像繪制及數據處理。

2 結果與分析

2.1 沒食子酸標準曲線

以沒食子酸質量濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制沒食子酸標準曲線，如圖1所示。

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

2.2 黑糯米酒釀酒工藝優化

2.2.1 單因素試驗

2.2.1.1 發酵時間對總酚含量及感官評分的影響

在新基質曲添加量為15%，泡米時間為5 h，發酵溫度為 30 ℃的條件下，發酵時間分別為 4、5、6、7、8、9 d，于30 ℃恒溫培養箱中發酵，研究發酵時間對黑糯米酒總酚含量和感官評分的影響，結果如圖2所示。

圖2 發酵時間對黑糯米酒總酚含量和感官評分的影響Fig.2 Effect of fermentation time on total phenol content and sensory score of black glutinous rice wine

由圖2可知，總酚含量隨著發酵時間增加而增加，當發酵時間到7 d 時，總酚含量達到最高0.643 mg/mL，但是感官評分在8 d 時感官評分值達到最大84 分。發酵初期，在酵母和霉菌作用下，黑糯米和藥材中的多酚溶于發酵液中，在發酵過程中乙醇含量增加，酚類物質中部分屬于醇溶性，可能導致總酚含量降低[14-15]。研究表明，酚類物質可以在多級反應中被氧化[16]，這也可能是造成其含量降低的原因。綜合以上因素，因此選擇6、7、8 d 發酵時間進行正交試驗。

2.2.1.2 發酵溫度對總酚含量及感官評分的影響

在泡米時間5 h，新基質曲添加量為15%，發酵時間為 7 d 的條件下，發酵溫度分別為 24、28、30、34、37 ℃，研究發酵溫度對黑糯米酒總酚含量和感官評分的影響，結果如圖3所示。

圖3 發酵溫度對黑糯米酒總酚含量及感官評分的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on total phenol content and sensory score of black glutinous rice wine

由圖3可知，黑糯米酒總酚含量和感官評分均隨著發酵溫度的增加呈現先增加后減小的趨勢，當發酵溫度34 ℃時，兩者達到最大分別為0.565 mg/mL 和83分。這是由于酶促反應中溫度對酶促反應的影響較大，在適宜溫度時，酶促反應才能達到最佳[17-19]。因此選擇發酵溫度30、34、37 ℃進行正交試驗。

2.2.1.3 新基質曲添加量對總酚含量及感官評分的影響

在發酵時間7 d，發酵溫度為30 ℃，泡米時間5 h的條件下，新基質曲添加量分別為6%、8%、10%、12%、15%、20%，研究新基質曲添加量對黑糯米酒總酚酮含量和感官評分的影響，結果如圖4所示。

圖4 新基質曲添加量對黑糯米酒總酚含量及感官評分的影響Fig.4 Effects of new matrix koji on total phenol content and sensory score of black glutinous rice wine

由圖4可知，黑糯米酒感官評分隨著新基質曲添加量的增加總體呈先增加后降低的趨勢，當新基質曲添加量達到15%時，感官評分最高為82.6 分。這可能是新基質曲為藥食同源物質所制，添加量小，藥香味不足，口感清淡，添加過量會導致藥味過濃，影響口感[18]。在新基質曲添加量為6%～10%的范圍內總酚含量變化不大，新基質曲添加量大于10%后總酚含量呈先增加后減小的趨勢，當新基質曲添加量達到15%時，總酚含量最高為0.845 mg/mL。這是因為新基質曲為藥食同源基質制得，酚類物質含量較豐富，因此總酚會隨著新基質曲添加量的增加而增加，隨著發酵進行，酚類物質在發酵液中趨于飽和，但隨著乙醇增多，其他醇溶性物質溶出增多，酚類物質被氧化，使得總酚含量下降。因此選擇新基質曲添加量12%、15%、20%進行正交試驗。

2.2.1.4 泡米時間對黑糯米酒總酚含量及感官評分的影響

在新基質曲添加量為15%，發酵時間為7 d，發酵溫度 30 ℃條件下，泡米時間分別為 0、3、5、7、9 h，研究泡米時間對黑糯米酒總酚含量和感官評分的影響，結果如圖5所示。

圖5 泡米時間對黑糯米酒總酚含量及感官評分的影響Fig.5 Effects of soaking time on total phenol content and sensory score of black glutinous rice wine

由圖5可知，黑糯米酒感官評分隨著泡米時間增加呈現先增加后減小的趨勢，當泡米時間在7 h 時，分數最高86 分，總酚含量在泡米5h 時達到最大0.591 mg/mL。泡米時間短，米粒過硬導致蒸煮不完全，發酵時酚類物質無法更好溶解除，時間過長，米皮表面花青素隨著水流失，導致酚類物質減少[20]。因此選擇泡米時間3、5、7 h 進行正交試驗。

2.2.2 正交試驗結果

2.2.2.1 正交試驗設計結果分析

正交試驗結果與分析見表3。

由表3可知，影響黑糯米酒總酚含量的各因素的主次順序為D＞C＞A＞B，影響黑糯米酒感官品質的各因素的順序為 A＞D＞C＞B。

2.2.2.2 正交試驗方差分析結果

以總酚含量和感官評定為評價指標的方差分析結果見表4和表5。

表3 黑糯米酒發酵工藝正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation technology optimization of black glutinous rice wine

表4 以總酚為評價指標正交試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results using total phenol content as evaluation index

表5 以感官評定為評價指標正交試驗結果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experiments results using sensory evaluation as evaluation index

續表5 以感官評定為評價指標正交試驗結果方差分析Continue table 5 Variance analysis of orthogonal experiments results using sensory evaluation as evaluation index

由表4可知，發酵時間、發酵溫度、新基質曲添加量、泡米時間均對黑糯米保健酒總酚含量和感官評分均有顯著性影響（P＜0.05）。以總酚含量為指標時，配方的最優組合為A1B2C3D3，以感官評分為指標時，最優組合為A2B2C2D2。根據K 值的大小比較，以及綜合分析認為，黑糯米酒發酵的最優參數為A1B2C2D3，即發酵時間6 d，發酵溫度34 ℃，新基質曲添加量15%，泡米時間7 h，在此條件下進行3 次驗證試驗，得黑糯米酒感官評分為86 分，總酚含量為0.85 mg/mL。

3 結論

本研究以枸杞、山藥、覆盆子等12 種藥食同源物質為基質制成的酒曲為發酵曲，通過單因素和正交試驗對黑糯米酒的釀造工藝進行優化。試驗結果表明，最佳工藝參數為發酵時間6 d，發酵溫度34 ℃，新基質曲添加量15%，泡米時間7 h。在此優化條件下得到感官評分為86 分，總酚量為0.85 mg/mL 的黑糯米酒，釀造的米酒具有柔和色澤和黃酒特有的醇香，甜潤爽口且具有一定的保健功能。