腸道益生菌體外發酵山藥低聚糖產短鏈脂肪酸的研究

劉 露， 張 雁， 魏振承， 鄧媛元， 丘銀清， 張惠娜

(1.廣東省農業科學院 蠶業與農產品加工研究所/農業部功能食品重點實驗室/廣東省農產品加工重點實驗室, 廣東 廣州 510610；2.華中農業大學 食品科學技術學院， 湖北 武漢 430070)

短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFA)，是由1～6個碳原子組成的有機脂肪酸。在人體內可由非消化性碳水化合物經結腸微生物發酵后產生，主要包括乙酸、丙酸、丁酸、乳酸等[1]。SCFA在體內參與不同器官的代謝，發揮各自的功效[2]，如乙酸是膳食纖維發酵的主要代謝產物[3]。在機體內，大部分乙酸經吸收進入肝臟代謝，作為周邊組織的能源，除進入肝臟外，還可被脾、心臟、肌肉等組織攝入和利用，是機體從小腸不能消化吸收的碳水化合物中得到能量的主要途徑[4]；丙酸經血液吸收后在肝臟中分解代謝，參與丙酮酸逆轉化葡萄糖的過程，同時，還可能抑制脂肪和膽固醇的合成[5]；丁酸是結腸的主要能量來源，能夠調節細胞增殖和分化[6]，同時，具有抗腫瘤的作用[7]；乳酸可降低腸道內環境的pH值，對腸道致病菌如沙門氏菌(Salmonella)、大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)等有抑制作用，還能促進腸道蠕動，調節腸道菌群的平衡[8]。

國內外研究表明，低聚糖具有預防便秘、結腸癌、腫瘤、糖尿病、冠心病等功效[9]，特別是具有調節腸道微生態平衡的作用[10]。腸道益生菌可通過發酵低聚糖產SCFA調節腸道健康[11-12]，且發酵低聚糖可產出相對于其他碳源底物更高含量的SCFA或調節某類SCFA的含量。植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和雙歧桿菌(Bifidobacterium)體外發酵低聚半乳糖，比以葡萄糖為碳源可產生更多的乳酸及SCFA[13]；青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)體外發酵半乳甘露低聚糖，比以半乳糖和甘露糖為碳源可產生更多的SCFA[14]；半乳糖和乳果糖復合低聚糖可通過提高SCFA含量來調節腸道健康[15]；木寡糖可使雙歧桿菌屬的數量顯著增加，并促進有益SCFA的形成[16]。SCFA的種類和數量受到發酵底物的數量[17]、類型[18]及發酵菌種[19]和發酵環境[20]等因素的影響。通過測定發酵培養基中SCFA的含量，可以更全面地評價體系中菌種發酵底物的變化情況，同時，也可反映菌群的活性。

前期研究表明，山藥低聚糖可被腸道益生菌群利用，對青春雙歧桿菌、動物雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalis)[21]、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)和嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)的體外生長促進作用良好[22]。 目前，有關山藥低聚糖的功效研究集中于免疫調節、抗氧化和促進益生菌生長等領域[23-25]，腸道益生菌發酵山藥低聚糖產SCFA的研究暫未見報道。采用體外模擬腸道內環境的方法，分析青春雙歧桿菌、動物雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)和植物乳桿菌等腸道益生菌發酵山藥低聚糖產生SCFA的種類和含量，希望為深入探討山藥低聚糖的益生功能提供理論基礎，為山藥及其低聚糖的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵棍山藥購于廣州市越秀區果蔬批發市場，產地河南，新鮮度和成熟度良好；嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、植物乳桿菌、青春雙歧桿菌和動物雙歧桿菌以及培養基生化試劑均購于廣州市微生物研究所；其余化學試劑均為市售分析純。

體外結腸環境培養基根據參考文獻[26]的方法制備, 稍作改進：以山藥低聚糖(自制)作為碳源。配方為(g/L蒸餾水)：山藥低聚糖13；黏蛋白4.0，酪蛋白3.0，蛋白胨5.0，胰蛋白胨5.0，膽鹽0.4，酵母浸膏4.5，FeSO4·7H2O 0.005，NaCl 4.5，KCl 4.5，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 1.25，CaCl2·6H2O 0.15，NaHCO31.5，半胱氨酸 0.8，氯高鐵血紅素 0.05，吐溫80 1.0。121 ℃高壓滅菌15 min。

乳酸菌基礎培養基(改良MRS培養基)用于嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌的活化，配方(廣州市微生物研究所提供)如下：胰蛋白胨 10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，檸檬酸2.0 g，葡萄糖20.0 g，KH2PO42.0 g，乙酸鈉5.0 g，吐溫80 1.0 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，硫酸錳0.25 g，K2HPO42.0 g。蒸餾水定容1 000 mL，pH值6.2～6.5，121 ℃高壓滅菌15 min。

青春雙歧桿菌基礎培養基用于青春雙歧桿菌的菌種活化，配方(廣州市微生物研究所提供)如下：大豆蛋白胨5.0 g，胰胨5.0 g，酵母粉10.0 g，葡萄糖10.0 g，鹽溶液40 mL，L-半胱氨酸0.5 g，0.1%刃天青1.0 mL。pH值6.5～7.0，121 ℃高壓滅菌15 min。其中鹽溶液的配制：CaCl20.2 g、MgSO4·7H2O 0.48 g，K2HPO41.0 g，KH2PO41.0 g，NaHCO310.0 g，NaCl 2.0 g。蒸餾水定容1 000 mL，pH值6.5。

動物雙歧桿菌基礎培養基用于動物雙歧桿菌的菌種活化，配方(廣州市微生物研究所提供)如下：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖5.0 g，K2HPO40.45 g，KH2PO40.33 g，NH4Cl 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，L-半胱氨酸 0.5 g，0.1 %刃天青1.0 mL，Na2S·9H2O 0.5 g。pH值7.5，121 ℃高壓滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

BS2105型電子天平，德國Sartorius公司；Agilent 1200型液相色譜儀，美國Agilent科技有限公司；Agilent 1200 series DND型檢測器，美國Agilent科技有限公司；壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；LRH- 250型生化培養箱，上海一恒科技有限公司；YQX- Ⅱ型厭氧培養箱，上海躍進醫療器械有限公司；JJ- CJ- 1F型潔凈工作臺，吳江市凈化設備總廠；VORTEX- 5型旋渦混合器，廣州市深華生物技術有限公司；KS- 300EⅡ型超聲波清洗機，寧波海曙科生超聲設備有限公司；3- 18K型臺式高速冷凍離心機，德國Sartorius公司；MilliQ Plus型超級純水儀，美國Milllpore公司；制冰機，美國Scotsman(斯科茨曼)公司；FDU- 1200型冷凍干燥機，日本東京理化。

1.3 實驗方法

1.3.1山藥低聚糖的制備

采用參考文獻[27]的方法制備山藥低聚糖。所得山藥低聚糖提取物中低聚糖含量為78.46%±0.29% 。

1.3.2菌種的活化

乳酸菌菌種活化：在無菌操作條件下，取乳酸菌凍干粉菌種，接種于10 mL脫脂乳中，充分振蕩后，(37±1) ℃靜置培養，凝固后以5%的接種量繼續培養傳代。傳代3次后，取第3代菌液4 ℃保存備用。

雙歧桿菌活化：在無菌無氧操作條件下，取雙歧桿菌凍干粉，用雙歧桿菌基礎培養基溶解，接種于雙歧桿菌基礎培養基上，(37±1) ℃厭氧培養48 h，用5%的接種量繼續培養傳代。活化后，傳代3次，取第3代菌液-80 ℃保存備用。

1.3.3山藥低聚糖發酵

菌種活化完成后，在無菌條件下，按照5%的接種量分別接于以山藥低聚糖為碳源的體外結腸環境培養基中。厭氧培養0、4、8、12、24 h后，測定發酵液pH值，同時，取發酵液于滅菌的聚乙烯管中，保存，待分析用。

1.3.4SCFA含量的測定[28-29]

1.3.4.1 色譜條件的選擇

色譜柱為SB- AQ柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，進樣量為20 μL，流動相為0.01 mol/mL KH2PO4(磷酸調節pH值為2.65±0.05)與甲醇，二者體積比為97∶3，流速為0.8 mL/min，柱溫25 ℃，紫外檢測器檢測波長為210 nm。

1.3.4.2 SCFA標準曲線的繪制

取乳酸、乙酸和丙酸三種標準品各20.00 mg，以超純水定容至10.00 mL，配制成標準溶液。分別取各標準溶液25、50、100、125、250、500、1 000 μL，以超純水定容至1.00 mL，配制成標準系列。以SCFA標準溶液濃度為橫坐標，相應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程。樣品中待測組分用保留時間和峰高增量法定性，標準曲線法定量。

根據HPLC測定結果得出，乳酸的標準曲線為Y=458.9X+7.101 3，R2=0.999 8；乙酸的標準曲線為Y=807.86X+4.565 1，R2=0.999 9；丙酸的標準曲線為Y=829.35X-0.888 6，R2=0.999 3。

1.3.4.3 樣品測定

取發酵液1 mL，加入0.01 mol/mL磷酸100 μL，離心5 min(10 000 r/min)。取上清液100 μL，稀釋至500 μL，經0.25 μm孔徑濾膜過濾后進行HPLC分析。相同色譜條件下檢測標準品及樣品，根據保留時間和峰面積確定樣品中對應的SCFA及其含量。

1.4 數據處理和統計分析

2 結果與分析

2.1 4種乳酸菌發酵山藥低聚糖產SCFA分析

2.1.1 4種乳酸菌發酵山藥低聚糖產乳酸分析

4種乳酸菌利用山藥低聚糖發酵產乳酸結果如圖1。圖中顯示，發酵液中乳酸含量均隨發酵時間延長而增加，在48 h時分別為(4.19±0.27)、(7.53±0.10)、(7.09±0.01)、(13.80±0.24) mg/mL，其中嗜熱鏈球菌在8 h的乳酸含量顯著高于4 h，隨后其乳酸含量趨于穩定，無顯著增加趨勢。在0～48 h發酵時間內，植物乳桿菌發酵能力一直強于其他3種乳酸菌，是產乳酸量最多的菌種；在0～8 h內嗜熱鏈球菌產乳酸能力強于嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌；隨著發酵持續，在12 ～48 h，嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌發酵產乳酸能力超過嗜熱鏈球菌。

不同小寫字母表示差異顯著。圖1 發酵時間對4種乳酸菌產乳酸的影響Fig.1 Impacts of fermentation time on lactate acid production of 4 kinds of lactic acid bacteria

2.1.2 4種乳酸菌發酵山藥低聚糖產乙酸分析

4種乳酸菌發酵山藥低聚糖不同時間產生乙酸的變化情況如圖2。各乳酸菌隨發酵時間產乙酸的變化趨勢均不一樣。嗜熱鏈球菌發酵液中乙酸含量隨發酵時間增加，嗜熱鏈球菌發酵液中乙酸含量在4～12 h和24～48 h內無明顯變化，發酵48 h含量最高，為(0.260±0.003) mg/mL；嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌發酵液中乙酸含量隨發酵時間先增加后減少，嗜酸乳桿菌發酵液中乙酸含量在4 h時最高，為(0.34±0.02) mg/mL；保加利亞乳桿菌發酵液中乙酸含量在8～48 h內無顯著變化，發酵8 h含量最高，為(0.92±0.11) mg/mL；植物乳桿菌發酵液中乙酸含量在24 h時最高，為(0.70±0.02) mg/mL。

在0～48 h發酵時間內，保加利亞乳桿菌發酵能力一直強于其他3種乳酸菌，是產乙酸量最多的菌種；在0～12 h發酵時間內，嗜酸乳桿菌發酵液中乙酸含量高于嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌；24～48 h發酵時間內，嗜熱鏈球菌發酵液中乙酸含量高于嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌。發酵過程中出現乙酸含量下降的現象，究其原因，可能是乙酸發生分解所致。

不同小寫字母表示差異顯著。圖2 發酵時間對4種乳酸菌產乙酸的影響Fig.2 Impacts of fermentation time on acetic acid production of 4 kinds of lactic acid bacteria

2.1.34種乳酸菌發酵山藥低聚糖產丙酸分析

4種乳酸菌發酵山藥低聚糖不同時間產生丙酸的變化情況如圖3。相對于乳酸和乙酸，4種乳酸菌利用山藥低聚糖發酵產丙酸的含量均較少。嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌發酵液中丙酸含量均隨時間先增加后減少。嗜熱鏈球菌發酵液丙酸含量在4 h后開始減少，12 h后穩定，4 h時最高，為(0.042 0±0.000 3) mg/mL；保加利亞乳桿菌發酵液中丙酸含量在8 h后開始減少，12 h后穩定，8 h時最高，為(0.060 0±0.001 6) mg/mL；植物乳桿菌發酵液中丙酸含量在4 h后減少，8 h后穩定，4 h時最高，為(0.057 0±0.000 7) mg/mL；嗜酸乳桿菌發酵液中丙酸含量在4～48 h發酵時間內無顯著差異，4 h時含量最高，為(0.056 0±0.003 0) mg/mL。

在0～4 h發酵時間內，嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌發酵能力強于嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌；4～8 h發酵時間內，保加利亞乳桿菌發酵能力強于其他3種菌種；8～48 h發酵時間內，嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌發酵液中丙酸含量高于嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌。

不同小寫字母表示差異顯著。圖3 發酵時間對4種乳酸菌產丙酸的影響Fig.3 Impacts of fermentation time on propionic acid production of 4 kinds of lactic acid bacteria

2.2 2種雙歧桿菌發酵山藥低聚糖產SCFA分析

2.2.12種雙歧桿菌發酵山藥低聚糖產乳酸分析

青春雙歧桿菌和動物雙歧桿菌發酵山藥低聚糖不同時間產生乳酸的變化結果如圖4。在整個發酵過程中，青春雙歧桿菌和動物雙歧桿菌發酵液中乳酸的含量均隨時間延長而增加，在48 h時分別達到(0.760±0.005)、(3.500±0.040) mg/mL。在48 h發酵時間內，動物雙歧桿菌產乳酸的量顯著高于青春雙歧桿菌，但其發酵液中乳酸含量不及4種乳酸菌發酵液。

不同小寫字母表示差異顯著。圖4 發酵時間對2種雙歧桿菌產乳酸的影響Fig.4 Impacts of fermentation time on lactate acid production of 2 kinds of bifidobacteria

2.2.22種雙歧桿菌發酵山藥低聚糖產乙酸分析

青春雙歧桿菌和動物雙歧桿菌發酵山藥低聚糖不同時間產生乙酸的變化情況如圖5。在整個發酵過程中，青春雙歧桿菌和動物雙歧桿菌發酵液中乙酸的含量均隨時間不斷上升，在48 h時分別達到(1.230±0.020)、(1.850±0.003) mg/mL。在0～48 h發酵時間內，動物雙歧桿菌發酵山藥低聚糖產乙酸含量高于青春雙歧桿菌；且雙歧桿菌發酵山藥低聚糖產乙酸含量要高于4種乳酸菌。

不同小寫字母表示差異顯著。圖5 發酵時間對2種雙歧桿菌產乙酸的影響Fig.5 Impacts of fermentation time on acetic acid production of 2 kinds of bifidobacteria

2.2.32種雙歧桿菌發酵山藥低聚糖產丙酸分析

青春雙歧桿菌和動物雙歧桿菌發酵山藥低聚糖不同時間產生丙酸的變化情況如圖6。在0～48 h發酵過程中，雙歧桿菌發酵液中丙酸含量均較少，且動物雙歧桿菌產丙酸的量顯著性高于青春雙歧桿菌。動物雙歧桿菌發酵液中丙酸含量在8 h時最高，為(0.082±0.001) mg/mL；青春雙歧桿菌發酵液中丙酸含量在4 h時最高，為(0.050±0.001) mg/mL。與4種乳酸菌相比，雙歧桿菌整體發酵產丙酸含量要高于乳酸菌。

不同小寫字母表示差異顯著。圖6 發酵時間對2種雙歧桿菌產丙酸的影響Fig.6 Impacts of fermentation time on propionic acid production of 2 kinds of bifidobacteria

3 討 論

腸道健康日益受到重視，植物中活性成分經腸道微生物菌群發酵產SCFA研究已成為熱點。研究表明，腸道中的微生物菌群可在體外利用低聚糖[30]、多糖[31]、抗性淀粉[32]、膳食纖維[33]、茶葉兒茶素[34]等植物活性成分作為碳源發酵產生SCFA，隨著菌種、碳源等條件的變化，產生SCFA的種類和含量也各不相同。

SCFA的產生與發酵底物的種類以及細菌種類有著密切的關系。本實驗通過對腸道內主要的兩類優勢菌種：乳酸菌和雙歧桿菌，在模擬結腸環境中發酵山藥低聚糖產SCFA的研究，發現青春雙歧桿菌、動物雙歧桿菌2種雙歧桿菌及嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌4種乳酸菌均能利用山藥低聚糖發酵產生乙酸、丙酸和乳酸等SCFA，但產生SCFA含量差別較大。在相同的發酵時間內，4種乳酸菌發酵山藥低聚糖產乳酸量顯著高于2種雙歧桿菌，說明這4種乳酸菌發酵山藥低聚糖產乳酸的能力強于2種雙歧桿菌；而2種雙歧桿菌發酵山藥低聚糖產乙酸量顯著高于4種乳酸菌，說明雙歧桿菌發酵山藥低聚糖產乙酸的能力較強。

孔璐等[35]利用健康成人糞便提取物體外模擬低聚異麥芽糖的腸道發酵，分別添加嗜酸乳桿菌、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)6株外源乳酸菌于發酵體系，發現不同菌種促進低聚異麥芽糖腸道發酵產SCFA的能力不同，屎腸球菌和鼠李糖乳桿菌促進低聚異麥芽糖產生乙酸、丙酸和丁酸3 種短鏈脂肪酸的能力最強。郭文奎等[36]研究發現，兒童糞便發酵菌群體系中產生的SFCA要高于成人糞便發酵菌群系統。Holzapfell等[37]報道，腸道益生菌中乳酸桿菌(Lactobacillus)降解碳水化合物代謝物的能力非常強，可促進SCFA的產生；且腸道乳酸桿菌菌群的數量與SCFA濃度呈正相關，乳酸桿菌越多SCFA濃度也越高，但這一作用是在與腸道中其他產SCFA菌協同作用的結果[38]。SCFA的產生也與發酵底物及其他因素有關。Rycroftyc等[39]研究發現，低聚異麥芽糖發酵產生乙酸的能力高于低聚果糖、乳果糖等。張寧等[40]發現，不同聚合度大蒜果聚糖體外發酵產SCFA，聚合度低的大蒜果聚糖產SCFA量高于聚合度高的果聚糖。

不同的益生元經腸道益生菌群發酵利用，代謝產生不同種類和數量的SCFA對人體腸道環境產生不同影響，并在體內參與不同器官的代謝，發揮各自的功效。因此，可通過改善膳食結構來調節腸道益生菌產SCFA的種類和含量，向著有益于腸道及人體健康的方向發展。

4 結 論

1)山藥低聚糖在模擬結腸環境中可被嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌、青春雙歧桿菌、動物雙歧桿菌等腸道益生菌作為碳源利用，產生對人體健康有積極作用的乳酸、乙酸及丙酸等SCFA。

2)乳酸菌發酵山藥低聚糖產生乳酸、乙酸及丙酸的濃度與菌種及發酵時間有關。在48 h發酵過程中，乳酸在植物乳桿菌48 h發酵液中含量達最高，為(13.800±0.243) mg/mL；乙酸在動物雙歧桿菌48 h發酵液中含量達最高，為(1.850±0.003) mg/mL；丙酸則在動物雙歧桿菌8h發酵液中含量達最高，為(0.082±0.001) mg/mL。