抗獨特型抗體在食用農產品危害物監控中的應用研究

徐重新， 張 霄， 劉 媛， 胡曉丹， 朱 慶， 仲建鋒，盧麗娜， 林曼曼， 高美靜， 謝雅晶， 劉賢金

(江蘇省農業科學院 農產品質量安全與營養研究所/省部共建國家重點實驗室培育基地-江蘇省食品質量安全重點實驗室, 江蘇 南京 210014)

食用農產品是食品的基本原料和重要組成部分，是公眾日常生活必不可少的食物來源，其質量安全直接關乎老百姓的健康，乃至社會和諧穩定。威脅食用農產品質量安全的因素眾多，從產地環境的重金屬、生物和化學毒素污染，到生產過程中不可或缺的有毒有害農獸藥投入品，再到收儲運環節中滋生的致病和產毒微生物及其代謝毒素等。這些污染物危害風險幾乎貫穿整個產供鏈，給食用農產品造成嚴重損失，同時也給人類健康帶來重大安全隱患。對食用農產品產供全過程中質量安全危害物的治理、防控和監測工作，是各級政府主管部門和科研工作者不可推卸責任。

基于“免疫網絡學說”的抗獨特型抗體(anti-idiotype antibody，AId或Ab2)因具有抗原“內影像”效應，即具有與抗原相同的抗原決定簇，從而具有可以模擬抗原決定簇分子構象乃至類似生物活性的功能，被普遍認為是有望用于靶向設計抗原功能效應物的可行路徑[1-2]。抗獨特型抗體首先興起于生物醫藥和分子診斷領域，是目前國內外免疫原(特別是疑難免疫原)替代功能效應物創制的希望，已經在多種抗原替代功能效應物創制中獲得成功[3-7]。食用農產品質量安全危害物多數都具有免疫原或半免疫原性，其中一些種類如黃曲霉毒素、微囊藻毒素、嘔吐毒素等劇毒物質[8]，在制備其檢測用抗體時，不僅危害科研工作者和免疫動物的生命安全，更會造成生態環境的二次污染。抗獨特型抗體為這些危害物的無毒化抗原替代功能效應物靶向創制提供了新思路，同時也為研發和拓展更為安全的可替代有毒、有害、有爭議的農業投入品(如農藥、獸藥、轉基因等)生物活性效應物指明了方向。

近年來，國內外已經開始有抗獨特型抗體在食用農產品質量安全危害物監控上應用研究的報道。本文通過系統梳理食用農產品主要危害物種類，全面整理了抗獨特型抗體在這些危害物監控應用上的研究狀況，并結合作者及所在團隊近年相關研究成果，對其應用前景進行展望，探討存在的問題并提出擬解決的對策；旨在為研發和拓展新型安全的食用農產品質量安全危害物生物監測和生物防控材料提供有價值的文獻參考。

1 食用農產品質量安全主要危害物及其風險

食用農產品在產供過程中，威脅其質量安全的危害物種類眾多、來源廣、因素復雜、危害巨大，歸納起來，可以分為生物源危害物(包括食源性病毒、食源性致病微生物以及產毒真菌、農作物、水生生物和動物等)和化學危害物(包括農藥、獸藥以及重金屬和類金屬等)兩大類。食用農產品中主要危害物種類及其風險，見表1。

表1 食用農產品中主要危害物及其風險

續表1

2 抗獨特型抗體及其創制技術原理

抗體是動物機體免疫應答過程中產生的一類特異結合抗原的大分子蛋白質，根據血清型分析可以將其分為同種型(isotype)、同種異型(allotype)和獨特型(idiotype, Id或Ab1)三類；其中獨特型類型是存在抗體分子表位上的獨特型抗原決定簇的統稱，具有特異型抗原識別結合的特性，可以出現在抗體分子的互補決定區、骨架區甚至是Fc片段區域[1]。1974年，Jerne首次提出“免疫網絡學說”[9]，認為動物機體受到免疫刺激后，免疫系統會發生一系列的應激級聯免疫反應，由抗原刺激產生抗體，抗體刺激又會產生抗抗體，如此推進，最后調節體內免疫機能達到穩定狀態。由此推斷并經證實，獨特型抗體會刺激產生抗獨特型抗體，按其與獨特型抗體結合的特點和功能可分為4類[1]：將骨架區的獨特位誘導產生的抗獨特型抗體稱為Ab2α，互補決定區的獨特位誘導產生的抗獨特型抗體稱為Ab2β，由靠近和位于互補決定區的獨特位誘導產生的抗獨特型抗體稱為Ab2γ，以及由遠離和位于互補決定區的獨特型抗體誘導產生的抗獨特型抗體稱為Ab2ε。抗原免疫產生獨特型抗體及進一步誘導抗獨特型抗體產生過程，見圖1(參考文獻[10]，并有細節優化)。圖1中，Ab2β抗獨特型抗體因直接由獨特型抗體互補決定區(即抗原結合區域)誘導產生，具有抗原“內影像”效應，在三維結構上與初始抗原類似，由此可以被用于原抗原構象乃至生物活性的功能替代效應物創制[11-12]。目前，采用抗原多克隆抗體、單克隆抗體以及它們的Fab或F(ab)2片段作為免疫原(用于免疫動物)或包被抗原(用于人工抗體庫淘篩)，是生物醫藥、分子診斷以及免疫檢測領域創制具有抗原功能效應物的抗獨特型抗體的主流方式，涉及的抗獨特型抗體類型包括多克隆抗體、單克隆抗體和新型人工抗體(如單鏈抗體、納米抗體)等形式[1, 13-15]。

圖1 抗原免疫產生獨特型抗體及進一步誘導抗獨特型抗體產生過程Fig.1 Schematic diagram of antigen immunization to produce idiotypic antibodies and further induction of anti-idiotypic antibodies production

3 抗獨特型抗體創制技術在食用農產品危害物監控中的應用研究狀況

抗獨特型抗體作為一種可模擬抗原構象乃至生物活性的特殊抗體，在食用農產品質量安全危害物檢測用抗體材料和安全的生物活性效應物創制上早有探索研究的報道。近20年來，國內外公開可查的相關文獻資料見表2。目前抗獨特型抗體及其創制技術已經在食用農產品生物毒素危害物替代檢測、生物農藥活性替代效應物和致病微生物可替代免疫原等創制上有相應報道，且最主要集中在高危高毒生物毒素的無毒化構象模擬用于替代免疫檢測的研究；就抗獨特型抗體形式而言，已經涵蓋了多克隆抗體、單克隆抗體以及新型人工抗體中的單鏈抗體、單域納米抗體以及7肽和12肽抗體等；早期以單克隆抗體類型為主，最近幾年人工抗體類型逐漸成為新的熱點。早在1998年，Tsutsumi等[16]以微囊藻毒素單克隆抗體為免疫原，通過免疫小鼠成功制備了其抗獨特型單克隆抗體，并建立了酶連免疫檢測方法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)，測得中抑制質量濃度(half-maximum inhibition, IC50)為0.45 ng/mL；Maragos等[17]以嘔吐毒素單克隆抗體Fab片段為免疫原，制備了嘔吐毒素抗獨特型多克隆抗體血清，初步測得其IC50為0.1 μg/mL；此外，He等[18]、Wang等[19]、Shu等[20]和Qiu等[21]借助噬菌體人工抗體庫及其抗原特異性高通量篩選技術，分別篩選到了赭曲霉毒素、黃曲霉毒素、伏馬毒素和Bt Cry1Ab毒素的抗獨特型人工抗體，并用于毒素檢測。作者所在的科研團隊，近年集成抗獨特型抗體創制技術、噬菌體人工抗體庫構建和高通量淘篩、鑒定技術以及抗體親和成熟技術，并依托單克隆高通量自動挑選和生物分子互作高通量分析系統，以Bt Cry殺蟲蛋白抗體為包被靶點，從人源化噬菌體單鏈抗體庫中靶向篩選到了系列具有模擬Bt Cry殺蟲功能的抗獨特型人源殺蟲蛋白，經靶標害蟲生測實驗證實，系列材料對小菜蛾和稻縱卷葉螟具有良好殺蟲活性，相關成果已獲國家專利和PCT國際專利授權[22-25]。

表2 抗獨特型抗體在食用農產品危害物監控中的研究報道

LOD：檢出限。

4 結 語

抗獨特型抗體目前在生物醫藥領域研究較多、對象較廣，實際應用也相對較為成熟，部分產品已經進入臨床試驗，其中具有模擬肺癌腫瘤抗原NeuGcGM3的抗獨特型抗體藥物Racotumomab(商品名為Vaxira)已投入市場[35]。在食用農產品質量安全危害物監控上，目前還僅限于高毒高危生物毒素、致病微生物以及個別生物農藥的無毒化可替代免疫原供檢測或生物活性效應物的靶向創制，且均處于初步探索階段，尚無商品化產品。整體而言，無論是在生物醫藥、分子診斷還是農產品、食品質量安全危害物檢測及控制等領域，抗獨特型抗體技術仍處于萌芽起步階段，受關注度相對偏少，可替代抗原功效的產品微乎其微。究其原因，主要受到兩方面問題制約。

1)技術流程復雜。創制抗獨特型抗體的前提是必須先制備針對抗原決定簇的獨特型抗體，然后再經獨特型抗體才有可能靶向獲得抗獨特型抗體，即要經歷兩次免疫或庫篩選，其中任何一個環節失誤都會干擾后續結果，只有各個步驟恰到好處，才有可能獲得具有模擬功效的抗獨特型抗體。針對該問題建議：在“免疫網絡學說”理論無法突破的前提下，探索以人工抗體庫替代傳統動物免疫，并組合人工抗體高通量篩選和鑒定系統。這是提高篩選效率較為可行的辦法，現已有初步成功應用的實例，見表2。

2)模擬功效難盡人意。抗獨特型抗體是免疫應激級聯反應隨機產生的一種特殊抗體，無論是采用動物免疫還是人工抗體庫淘篩方式，均無法避免抗體分子上非抗原決定簇的巨大干擾。要想恰到好處地獲得針對獨特型抗體互補決定區，且能完整模擬抗原構象的Ab2β，其難度系數不亞于大海撈針，更不要說可替代抗原生物活性的效應物。針對該問題建議：從獨特型抗體角度，盡量剔除非抗原決定簇，減少干擾；從制備效率角度，可以探索集成串聯動物體內富集(免疫)、人工抗體庫體外富集(構建抗獨特型抗體免疫庫)，最后借助蛋白質互作同源建模和熱點預測分析等生物信息學手段對捕獲模擬物進行親和成熟(如點突變、鏈置換等)[36-38]。

總的來說，抗獨特型抗體作為具有模擬免疫原構象乃至生物活性功能的特殊抗體材料，在食用農產品質量安全危害物管控上具有很大挖掘潛力，特別是在生物防控方面(如拓展安全的、環境友好的新型農獸藥以及防腐保鮮劑等多肽材料)具有重要科學意義。