高效液相色譜法測定復方氨基酸（15）腹膜透析液中色氨酸降解產物

謝紀珍，崔師睿，周 沖*，尹寧寧，姜曉飛

（1.山東省食品藥品審評認證中心，山東 濟南 250014；2.山東農業工程學院，山東 濟南 250100）

復方氨基酸（15）腹膜透析液是一種用氨基酸替代葡萄糖作為滲透劑，用于營養不良的腹膜透析患者的新型透析治療產品。其處方組成復雜，含有包括色氨酸在內的15種氨基酸等，目前測定氨基酸含量的方法很多，包括高效液相色譜法（HPLC）、氨基酸分析儀、衍生化法等[1-2]，但測定各種氨基酸降解產物的方法較少，本文選擇穩定性較差的色氨酸為例[3]，對其檢測方法進行研究。在日常審評過程中發現，不同檢測方法檢出的色氨酸中降解產物和雜質個數均不同，通過對比美國藥典、歐洲藥典、英國藥典等收載的各種氨基酸原料的檢測方法，色氨酸是唯一一個采用HPLC測定降解雜質的氨基酸，其中歐洲藥典對色氨酸雜質的檢測相對完整，其收錄的色氨酸原料的雜質從合成過程中引入的雜質和降解雜質共有12個，并對其中的雜質A采用HPLC法檢測[5-8]。通過研究發現，該方法在評價色氨酸原料的穩定性方面基本可行，但復方氨基酸（15）腹膜透析液含有十幾種氨基酸組分，這些組分會干擾色氨酸雜質的測定，上述藥典中的檢測方法專屬性較差，不能有效地評價色氨酸的穩定性，為此本研究對檢測方法進行了優化和驗證。

在參考文獻的基礎上[4,9-10]，本研究進一步優化色譜條件，建立了一種專屬性更強的方法檢測制劑中色氨酸的降解雜質，測定并比較了自制復方氨基酸（15）腹膜透析液與上市品中的色氨酸降解雜質，為與本品類似的制劑產品開發提供了一種有效的質量控制和評價手段。

1 材料與試藥

Agilent1100型高效液相色譜儀，DAD檢測器，自動進樣器，Aglient Chemstation色譜工作站；XS205型電子天平（梅特勒-托利多）；PHS-3C型pH計（上海雷磁儀器廠）。色氨酸（中國食品藥品檢定研究院，批號140624-201506）；色氨酸雜質B（加拿大TLC Pharmaceutical Standards公司，批號1385-088A2）；色氨酸雜質C（犬尿氨酸，美國Sigma-Aldrich公司，批號BCBN9808V）；色氨酸雜質E（N-甲酰犬尿氨酸，雜質批號1406-083A3），色氨酸雜質G（2-羥基色氨酸，批號1406-094A3，加拿大TLC Pharmaceutical Standards公司）。復方氨基酸（15）腹膜透析液（青島力騰化工醫藥研究有限公司，批號C17031701，C17031702，C17031703）；另選某公司已上市復方氨基酸（15）腹膜透析液做對比研究，批號：S15G03096。

2 方法

2.1 雜質對照溶液配制

精密稱取雜質B、犬尿氨酸、N-甲酰犬尿氨酸、2-羥基色氨酸適量，加水制成濃度分別為99.6，107.8，119.2，97.2 μg/ml的對照溶液。2～8 ℃密封保存備用。

2.2 空白對照溶液配制

按照復方氨基酸（15）腹膜透析液處方，稱取除色氨酸以外的其他組分，加水，制成空白對照溶液。

2.3 對照混合溶液配制

精密稱取雜質B、犬尿氨酸、N-甲酰犬尿氨酸、2-羥色氨酸適量，用純化水溶解，制成各組分濃度約為0.50 μg/ml對照溶液，量取1 ml，加入100 ml復方氨基酸（15）腹膜透析液樣品中。

2.4 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以純水為流動相A，以0.02 mol/L磷酸二氫鉀（磷酸調pH 2.7）-乙腈-異丙醇（650:175:175）為流動相B，柱溫50 ℃，按表1進行梯度洗脫；檢測波長為250 nm。

表1 流動相洗脫梯度

2.5 測定法

取上述雜質對照溶液、空白對照溶液、對照混合溶液以及自制和上市的復方氨基酸（15）腹膜透析液各50 μl，注入色譜儀，記錄色譜圖至保留時間70 min。各雜質按外標法計算不得大于0.2 %，最大其他雜質不得大于0.2 %，總雜質不得過1.0 %。

3 方法對比與方法學驗證

3.1 色譜條件比較

氧化破壞樣品制備 稱取色氨酸對照品適量，加純化水溶解，取5 ml加30 %雙氧水5 ml，置入10 ml量瓶，于60 ℃下放置5 h，取出待用。取氧化破壞樣品溶液，分別用歐洲藥典8.0[2]中收載的色譜條件與上述優化后色譜條件分析測定。

結果：由圖1、圖2比較可見，氧化破壞后的樣品采用自研的方法檢測可將4個雜質全部檢出，而采用歐洲藥典方法檢出的雜質個數和分離度均較差（本文各圖中標號代表：1：雜質B，2：犬尿氨酸，3：N-甲酰犬尿氨酸，4：2-羥基色氨酸，5：色氨酸，6：苯丙氨酸，7：酪氨酸，8：雙氧水）。

圖1 歐洲藥典方法測定氧化后色氨酸溶液色譜圖

3.2 專屬性

3.2.1 原輔料空白試驗 按處方配制除色氨酸以外的各原輔料空白溶液、各雜質混合對照溶液、以及加各雜質對照的混合樣品溶液，照2.4和2.5項下色譜條件與測定法測定。

結果：由圖3～圖5可見，色氨酸的4個雜質在復方氨基酸（15）腹膜透析液的樣品中可有效分離，樣品中的色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸均不影響4個雜質的測定。

圖3 雜質對照溶液色譜圖

圖4 空白溶液色譜圖

圖5 加雜質對照的混合樣品溶液色譜圖

3.2.2 破壞性試驗 將氨基酸（15）腹膜透析液分別于高溫、光照、氧化條件下破壞。

圖6 注射液光照破壞色譜圖

圖7 注射液氧化破壞色譜圖

圖8 注射液高溫破壞色譜圖

結果：本方法能良好的分離注射液在光照、高溫、氧化條件下降解各雜質，且主峰純度符合要求。

3.3 復方氨基酸（15）腹膜透析液樣品中雜質檢測

由圖9、圖10可見，自制的復方氨基酸（15）腹膜透析液中色氨酸的雜質要低于上市品（已上市12個月）中的雜質水平。

圖9 氨基酸（15）腹膜透析液上市樣品色譜圖

圖10 氨基酸（15）腹膜透析液自制樣品色譜圖

3.4 線性范圍

分別取2.1項下各對照溶液適量，加水稀釋成系列濃度后照2.4和2.5項下色譜條件與測定法進行測定。以峰面積對濃度作回歸方程，結果見表2，表明各雜質濃度與峰面積呈良好的線性關系，符合要求。

表2 雜質的標準線性曲線

3.5 檢測限、定量限

分別取2.1項下各對照溶液適量，加水連續稀釋后照2.4和2.5項下色譜條件與測定法測定，直至信噪比為10:1時，該濃度為定量限濃度；當信噪比為3:1時，該濃度為檢出限濃度；配制6份定量限濃度對照混合溶液，連續進樣，計算其RSD，應符合要求。6份定量限樣品峰面積RSD值小于5 %，保留時間RSD小于2 %。結果見表3。

表3 雜質的檢測限和定量限

3.6 精密度

重復性試驗：取2.2項下混合樣溶液，照2.4和2.5項下色譜條件與測定法，測定6份樣品中雜質B、犬尿氨酸、N-甲酰犬尿氨酸、2-羥基色氨酸的含量。結果表明，6份樣品中雜質B平均含量為0.5362 μg/ml，RSD為4.6 %，犬尿氨酸平均含量為0.5399 μg/ml，RSD為0.8 %，N-甲酰犬尿氨酸平均含量為0.5216 μg/ml，RSD為2.6 %，2-羥基色氨酸平均含量為0.5488 μg/ml，RSD為2.2 %。

表4 重復性試驗結果

中間精密度試驗：取2.2項下混合樣溶液，照2.4和2.5項下色譜條件與測定法，由不同的儀器、試驗人員測定相同的6份樣品雜質含量，計算12份樣品的RSD值。結果表明，12份樣品中雜質B平均含量為0.5154 μg/ml，RSD為6.6 %，犬尿氨酸平均含量為0.5197 μg/ml，RSD為4.2 %，N-甲酰犬尿氨酸平均含量為0.5248 μg/ml，RSD為3.0 %，2-羥基色氨酸平均含量為0.5406 μg/ml，RSD為4.1 %。

結論：由上述重復性試驗與中間精密度試驗結果可知，該方法精密度良好。

3.7 穩定性試驗

取2.1項下各對照溶液，照2.4和2.5項下色譜條件與測定法，分別于0，4，8，12，24 h取樣測定其穩定性。結果雜質B、犬尿氨酸、N-甲酰犬尿氨酸和2-羥基色氨酸的樣品峰面積RSD分別為1.9 %，0.9 %，1.1 %和0.7 %。

3.8 回收率

精密量取2.1項下各對照溶液適量，按照低、中、高3個濃度稀釋配制含有4種雜質的溶液，每個濃度配制3份，共配制9份樣品溶液，其中低濃度為定量限濃度。照2.4和2.5項下色譜條件與測定法。結果雜質B、犬尿氨酸、N-甲酰犬尿氨酸和2-羥基色氨酸的平均回收率分別為101.78 %，106.31 %，104.86 %和100.71 %。詳見表5～8。

表5 雜質B回收率試驗結果（n=9）

表6 犬尿氨酸回收率試驗結果（n=9）

表7 N-甲酰犬尿氨酸回收率試驗結果（n=9）

表8 2-羥基色氨酸回收率試驗結果（n=9）

3.9 耐用性

分別考察流動相比例、流動相pH值、柱溫、檢測波長、流速不同色譜柱等方法因素發生變化時，該方法的耐受程度。每個條件下各測試2次。可接受的標準為：各雜質峰的拖尾因子不得大于2.0，雜質峰與其他成分峰必須達到基線分離；各條件下的雜質含量數據（n=6）的相對標準差應不大于2.0 %，雜質含量的絕對值在±0.1 %以內。

結果表明，上述各影響因素變化條件下，除流速為0.6 ml/min時分離度最小為1.43，其余各條件理論塔板數均大于10 000，分離度均大于1.5。犬尿氨酸、N-甲酰犬尿氨酸各影響因素條件下6份含量數據RSD值小于2.0 %，雜質B略過，最高RSD值為7.1 %，但對有關物質測定結果無明顯影響。

綜合上述，該方法空白原輔料無干擾，有關物質能夠實現良好的分離，專屬性強；定量限濃度均低于0.05 %，該方法靈敏度高；準確度、精密度良好，各雜質自定量限濃度至0.5 %范圍內濃度與峰面積成良好的線性關系；溶液在24 h內穩定，能夠滿足測定需求，系統適用性與耐用性良好。該方法能夠滿足本品中色氨酸有關物質檢測要求。

3.10 樣品測定

取自制復方氨基酸（15）腹膜透析液3批及市售產品，照2.4和2.5項下色譜條件與測定法測定。結果見表9。

表9 復方氨基酸（15）腹膜透析液中色氨酸降解產物測定結果

4 討論

歐洲藥典收錄的檢測方法在評價復方氨基酸制劑中色氨酸雜質時，受其他氨基酸組分影響，其專屬性差，不能有效檢測色氨酸的降解雜質。我們在其方法基礎上改進優化了HPLC色譜條件，可對其主要的降解產物進行分離檢測，經方法學驗證，可用于多種含色氨酸的復方氨基酸制劑工藝和質量評價，希望給研究者提供參考。