小兒牛黃清心散遺傳毒性研究

曲見松，祝清芬，趙 巖，孫昌華，趙艷霞，杜新磊，高 峰，張國印

（1.山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250101；2.山東廣育堂國藥有限公司，山東 濟寧 272000）

小兒牛黃清心散主要由天麻、膽南星、黃連等十四味中藥配伍而成，收載于《衛生部藥品標準》中藥成方制劑第2冊，為臨床較為常用的藥物，具有清熱化痰、鎮靜止痙的功效，對小兒支氣管肺炎、上呼吸道感染、熱性驚厥、小兒季節性流感和皰疹性咽峽炎等疾病具有較好的療效[1-5]。目前國內外對中藥安全性的評價研究日益引起關注，對于常用的組方藥物的功效也逐步使用試驗動物進行深入研究[6-10]。經查閱文獻發現，目前國內外對小兒牛黃清心散是否具有遺傳毒性的研究尚未見報道。考慮到小兒牛黃清心散使用對象的特殊性，有必要對其遺傳毒性進行評價。本文采用遺傳毒性標準組合試驗對小兒牛黃清心散的遺傳毒性進行了研究[11-12]。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BP 211D電子天平（德國Sartorius公司）；高壓蒸汽滅菌器（日本SANYO公司）；隔水式恒溫培養箱（上海一恒）；Stuart溫控搖床培養箱（英國Stuart公司）；BSC-1100A2生物安全柜（北京中聯哈爾儀器公司）；INC153二氧化碳培養箱（德國Memmert公司）；LEICA DMIL倒置顯微鏡（德國徠卡公司）。

1.2 試劑

小兒牛黃清心散（山東方健制藥）；肝微粒體酶S9（上海寶錄）；敵克松（Chem Service公司）；注射用絲裂霉素（浙江海正藥業）；2-氨基芴（上海晶純試劑公司）；1, 8-二羥基蒽醌（Sigma-Aldrich公司）；環磷酰胺（Sigma-Aldrich公司）；DMEM培養液（Hyclone公司）；胎牛血清（浙江天杭）；胰蛋白酶（賽默飛世爾）；Giemsa染料（Salarbio公司）；甲醇（天津康科德）；滅菌注射用水（華仁藥業）。

1.3 試驗系統

1.3.1 菌株 鼠傷寒沙門氏菌株TA97a，TA98，TA100，TA102，TA1535（上海寶錄）。

1.3.2 細胞株 中國倉鼠肺成纖維細胞（CHL，中國科學院典型培養物保藏委員會昆明細胞庫）。

1.3.3 動物 ICR小鼠，SPF級，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，生產許可證號：SCXK（魯）20140007。實驗在山東省食品藥品檢驗研究院屏障環境內進行，實驗動物使用許可證號：SYXK（魯）20130012。

2 方法

2.1 Ames試驗

TA97a，TA98，TA100，TA102，TA1535 5種菌株經鑒定符合鼠傷寒沙門菌組氨酸缺陷型的各項特性，體外活化系統S9為Aroclor1254誘導雄性SD大鼠肝勻漿。試驗設8，40，200，1000，5000 μg/皿5個劑量。將受試藥物配制成0.08，0.4，2，10，50 mg/ml 5個濃度，0.055 MPa滅菌20 min，試驗時，每皿加入各個劑量組受試物0.1 ml。同時設立自發回變組、溶媒對照組和陽性對照組。每組設3個平皿。在加 S9與不加 S9混合液的條件下以平板摻入法進行試驗，陽性對照組所用陽性物為敵克松、2-氨基芴、絲裂霉素C和1, 8-二羥基蒽醌。若受試物的回變菌落數為自發回變菌落數的2倍以上，并具有劑量-反應關系則判定為陽性。試驗在相同條件下進行2次以確保結果的可重復性。

2.2 CHL細胞染色體畸變試驗

采用生長狀態良好的CHL細胞進行試驗。用0.25 %的胰酶將細胞消化，吹打均勻后重新分瓶培養，接種的細胞密度為1×105個/ml。試驗在代謝活化（加S9）和非代謝活化（不加S9）條件下進行。非代謝活化條件下，受試藥品與細胞分別接觸4，24 h，代謝活化條件下，受試樣品與細胞接觸4 h。低、中、高劑量組藥物終濃度均分別為250，500，1000 μg/ml。試驗同時設陰性對照組和陽性對照組。各組收獲細胞前4 h加入終濃度為0.8 μg/ml的秋水仙堿，胰酶消化，離心收集細胞，用0.075 mol/L氯化鉀溶液將細胞進行低滲處理，甲醇-冰醋酸液固定，離心，取混勻沉淀物常規制片，姬姆薩染色。油鏡下觀察染色體結構畸變種類、頻率，每例樣本鏡檢200個中期相細胞，記錄染色體數目及形態的變化。

2.3 小鼠骨髓細胞微核試驗

取健康ICR小鼠50只，按體重隨機分為供試品500，1000，2000 mg/kg 3個劑量組、陰性對照組和環磷酰胺50 mg/kg陽性對照組，每組10只，雌雄各半。各組小鼠分別灌胃給予相應的藥物溶液20 ml/kg，陰性對照組經口灌胃給予等容積的滅菌注射用水。采用30 h兩次給藥法，即兩次給藥間隔24 h，于第二次給予受試物后6 h將動物頸椎脫臼處死，取胸骨骨髓常規制片、姬姆薩染色。顯微鏡閱片，每只小鼠骨髓涂片觀察2000個嗜多染紅細胞（PCE），計數出現微核的PCE，計算微核率，微核率以千分率表示。每只小鼠骨髓涂片至少觀察200個PCE細胞，并計算嗜多染紅細胞與總紅細胞[正染紅細胞（NCE）+PCE]的比例。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 Ames試驗結果

受試物各劑量組在加/不加S9（+/-S9）條件下各菌株回變菌落數均未超過自發回變菌落數的2倍，各劑量組間亦無劑量反應關系。兩次試驗結果表明，在本試驗條件下，在加與不加代謝活化系統的情況下，受試物為致突變陰性，結果見表1、表2。

表1 小兒牛黃清心散Ames試驗結果（，第1次試驗）

表1 小兒牛黃清心散Ames試驗結果（，第1次試驗）

注：**P＜0.01 vs 陰性對照組；1) 敵克松50 μg/皿；2) 2-氨基芴10 μg/皿；3) 絲裂霉素C 0.5 μg/皿；4) 1,8二羥基蒽醌50 μg/皿

組別 活化系統TA97a回變菌落數（n=3)TA98 TA100 TA102 TA1535陰性對照組 -S9 126±8 34±5 137±8 259±12 33±3 132±11 38±3 147±10 253±11 36±3陽性對照組 -S9 2147±9911)** 1965±1111)** 993±721)** 873±783)** 429±611)**2261±1202)** 2147±1052)** 1149±742)** 980±1114)** 309±242)**自發回變組 -S9 125±9 31±6 139±8 263±11 38±6 135±7 35±3 148±9 259±12 38±6 5000 μg/皿 -S9 107±13 29±5 134±11 241±7 32±3+S9 115±6 34±3 133±7 251±12 33±4 1000 μg/皿 -S9 117±14 32±6 136±13 265±8 35±6+S9 125±8 37±4 145±12 257±13 40±5 200 μg/皿 -S9 123±8 32±3 142±9 263±11 38±3+S9 127±11 38±3 153±8 265±14 34±2 40 μg/皿 -S9 129±12 35±4 136±12 259±10 34±4+S9 134±13 39±5 143±14 254±7 37±5 8 μg/皿 -S9 127±6 32±5 139±8 258±9 34±5+S9 131±5 40±4 140±12 264±11 35±4給藥組

表2 小兒牛黃清心散Ames試驗結果（，第2次試驗）

表2 小兒牛黃清心散Ames試驗結果（，第2次試驗）

注：**P＜0.01 vs 陰性對照組；1) 敵克松50 μg/皿；2) 2-氨基芴10 μg/皿；3) 絲裂霉素C 0.5 μg/皿；4) 1,8二羥基蒽醌50 μg/皿

組別 活化系統TA97a回變菌落數（n=3）TA98 TA100 TA102 TA1535陰性對照組 -S9 120±11 32±4 145±10 260±8 36±4 135±7 36±3 143±10 265±9 38±2陽性對照組 -S9 2148±1191)** 2035±811)** 1061±911)** 869±343)** 423±371)**2125±1122)** 2412±2332)** 1099±602)** 855±814)** 297±502)**自發回變組 -S9 125±10 34±5 149±9 259±10 36±6 137±5 37±4 144±8 263±14 37±4 5000 μg/皿 -S9 112±11 32±3 126±9 256±10 30±3+S9 124±9 34±4 137±10 252±11 31±3 1000 μg/皿 -S9 122±7 33±3 134±5 261±8 40±5+S9 136±9 38±5 141±13 257±12 34±4 200 μg/皿 -S9 121±13 35±3 137±13 258±12 34±3+S9 138±12 38±3 143±12 261±11 36±3 40 μg/皿 -S9 124±9 33±3 140±14 265±11 40±4+S9 132±9 40±4 147±12 255±10 37±3 8 μg/皿 -S9 125±8 36±2 143±8 264±9 35±3+S9 141±9 37±4 143±15 263±12 38±4給藥組

3.2 細胞染色體畸變試驗

在代謝和非代謝活化條件下，陽性對照組細胞畸變率與陰性對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。各受試藥品組細胞畸變率與陰性對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），各劑量組畸變率未呈現劑量反應關系，表明受試藥物在250～1000 μg/ml劑量范圍內，CHL細胞染色體畸變試驗結果為陰性，見表3。

表3 小兒牛黃清心散CHL細胞染色體畸變試驗結果

3.3 微核試驗結果

小兒牛黃清心散給藥組與陰性對照組相比，PCE/（NCE+PCE）差異無統計學意義（P＞0.05），陽性對照組與陰性對照組相比，PCE/（NCE+PCE）差異有統計學意義（P＜0.01），表明小兒牛黃清心散對骨髓細胞的造血功能沒有產生抑制意義（P＞0.05），陽性對照組骨髓微核發生率與陰性對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.01），見表4。

表4 小兒牛黃清心散對小鼠骨髓細胞微核率的影響

4 討論

經細菌回復突變試驗預試驗發現，受試菌株TA100在小兒牛黃清心散作用濃度達最大劑量5000 μg/皿時，細菌回變菌落數無明顯減少，各劑量組與陰性對照組之間差異無統計學意義，表明小兒牛黃清心散在5000 μg/皿及以下劑量對試驗菌株無毒性作用。因此，正式試驗時選用最高劑量5000 μg/皿，其余劑量按指導原則要求分別設定為1000，200，40，8 μg/皿。

在進行染色體畸變試驗時，由于細胞培養所用培養基一般對熱敏感，因此可將小兒牛黃清心散預先滅菌處理后，再用DMEM培養液進行配制。本品在濃度較高時，如5 mg/ml濃度時對CHL細胞未顯示出細胞毒性，但易沉淀在培養瓶底部影響細胞生長和細胞狀態觀察，并對后續染色體試驗產生影響，因此根據指導原則要求，本研究試驗最高劑量選用1 mg/ml，試驗可操作性和結果良好。

急性毒性試驗研究發現，小兒牛黃清心散對嚙齒類動物毒性低，急性毒性未求出LD50。根據藥物遺傳毒性研究技術指導原則，我們在小鼠骨髓細胞微核試驗中，試驗最高劑量設為2000 mg/kg BW，中、低劑量組設定為1000，500 mg/kg BW。

根據3項遺傳毒性試驗結果，可認為小兒牛黃清心散在本試驗劑量范圍內未見遺傳毒性作用。