HPLC測定牛黃上清丸中膽紅素的含量

龐 靜，王 健，王曉云，韓 笑，劉凱娜，郭金穎

（秦皇島市食品藥品檢驗中心，河北 秦皇島 066000）

牛黃上清丸為甲類OTC，1977至2015年版《中國藥典》均有收載，處方來源于明代李梃《醫(yī)學(xué)入門》牛黃上清丸加減方，由人工牛黃、薄荷、菊花、荊芥穗、白芷、川芎、梔子、黃連、黃柏、黃芩、大黃、連翹、赤芍、當(dāng)歸、地黃、桔梗、甘草、石膏、冰片十九味藥組成，具有清熱瀉火，散風(fēng)止痛的功效。用于熱毒內(nèi)盛、風(fēng)火上攻所致的頭痛眩暈、目赤耳鳴、咽喉腫痛、口舌生瘡、牙齦腫痛、大便燥結(jié)。牛黃上清丸處方中人工牛黃性涼，是清熱解毒之佳品，為君藥[1-2]。膽酸和膽紅素是人工牛黃的主要成分，且膽紅素是評價人工牛黃質(zhì)量優(yōu)劣的重要指標(biāo)性成分[3-5]，現(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1]僅對膽酸、豬去氧膽酸進(jìn)行了薄層色譜鑒別質(zhì)控，無膽紅素控制方法。有文獻(xiàn)報道采用比色法、分光度法、薄層色譜法、高效液相色譜法等測定人工牛黃（牛黃）藥材或一些制劑中膽紅素的含量[6-13]，另有牛黃上清片中膽紅素含量測定方法[14-15]的報道，在參考已有文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，本文采用高效液相色譜法測定牛黃上清丸中膽紅素的含量，方法準(zhǔn)確、可靠，可用于牛黃上清丸的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AHT型高效液相色譜儀（日本島津），AG-135型十萬分之一電子天平（Mettler Toledo），DL-1028H型超聲波清洗器（Bandelin），TDL-60B型低速臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），Super型漩渦混合器（德國愛安姆科技有限公司）。

1.2 試藥

膽紅素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號100077-200805，含量98.5 %）；牛黃上清丸樣品（均為大蜜丸）由1～9藥廠提供；乙腈（MREDA，USA，色譜純），水為超純水，草酸、二氯甲烷、冰醋酸均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取膽紅素對照品10.56 mg，置100 ml量瓶中，用二氯甲烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密量取上述溶液3 ml，置50 ml量瓶中，加二氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，即得6.2410 μg/ml的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備 取本品約3 g，剪碎，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入10 %草酸溶液10 ml，水飽和二氯甲烷15 ml，稱定重量，渦旋混勻，超聲處理（功率500 W，頻率35 kHz）30 min，再稱定重量，用水飽和二氯甲烷補足減失的重量，搖勻，離心（4000 r/min）3 min，分取二氯甲烷液，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性對照溶液制備 按照處方，取人工牛黃以外的18味中藥材適量，按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1]中[制法]項依法操作，制成大蜜丸，并按2.1.2項下方法制備陰性對照溶液。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Wondasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-1 %冰醋酸溶液（95:5）；流速1.0 ml/min；檢測波長450 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μl。理論塔板數(shù)按膽紅素峰計算均大于6000，色譜峰分離度良好。色譜圖見圖1。

圖1 對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液的HPLC色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 分別精密量取對照品溶液0.25，0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 ml分別置10 ml量瓶中，加二氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，即得不同濃度的系列對照品溶液。按2.2項下色譜條件分別進(jìn)樣，測定峰面積，以濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)（X），峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=4 928 096X+751.38，r=0.9999（n=6）。膽紅素濃度在0.1560～1.560 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度 取2.1.1項下對照品溶液，精密量取1.5 ml置10 ml的量瓶中，加二氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，按2.2項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次測定峰面積，峰面積RSD為0.68 %，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗 取同一均勻樣品（批號5010066），平行取樣6份，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.2項下色譜條件分別進(jìn)樣測定。結(jié)果膽紅素平均含量為4.5609 μg/g，RSD為0.96 %，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液，分別于0，4，8，10，12 h進(jìn)樣測定，記錄峰面積，結(jié)果膽紅素峰面積RSD為1.11 %，表明供試品溶液在室溫下12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率測定 精密稱取已知含量（批號5010066，含量：4.5609 μg/g）的供試品9份，每份約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，制備3個濃度的供試品溶液，每個濃度平行制備3份，分別按供試品含量的50 %，100 %，150 %加入按2.1.1項下方法配制的膽紅素對照品溶液（6.2410 μg/ml）0.5，1.0，1.5 ml，按2.1.2項下方法自“精密加入10 %草酸溶液10 ml……”起，制備供試品溶液，按2.2項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算回收率。結(jié)果表明，膽紅素的平均加樣回收率為100.00 %，RSD為1.27 %（n＝9），本方法回收率較好。見表1。

表1 膽紅素加樣回收率測定結(jié)果

2.4 樣品測定

取不同廠家的9批次的牛黃上清丸，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，并按2.2項下色譜條件測定含量，測定結(jié)果見表2。

表2 膽紅素含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 試驗中注意事項

據(jù)文獻(xiàn)報道[15]，因丸劑中含有蜂蜜，妨礙膽紅素溶出，且丸劑中膽紅素含量較低，在樣品處理過程中操作繁瑣，提取濃縮時間較長，又因膽紅素對光[16]、熱均不穩(wěn)定，易造成含量結(jié)果偏低，所以在試驗過程需避光操作、快速提取且選擇了較低的色譜柱溫度。

3.2 含量測定結(jié)果分析

2015年版《中國藥典》（一部）要求人工牛黃中膽紅素的含量不得低于0.63 %，按此含量及處方量計算，牛黃上清丸中最少應(yīng)含有膽紅素7.0460 μg/g。采用本方法，測定了9個不同廠家的牛黃上清丸中膽紅素的含量，結(jié)果膽紅素的含量范圍為1.8262～6.3945 μg/g，轉(zhuǎn)移率分別為69.9 %，54.8 %，72.6 %，20.7 %，23.9 %，23.5 %，24.7 %，55.0 %，51.8 %，不同廠家膽紅素含量差異較大，所以檢測牛黃上清丸中膽紅素的含量很有必要。

3.3 流動相的選擇

本試驗比較了甲醇-乙腈-0.1 %磷酸、甲醇-1 %冰醋酸、乙腈-1 %冰醋酸系統(tǒng)的分離效果，結(jié)果以乙腈-1 %冰醋酸（95:5）為流動相時，膽紅素峰形良好且陰性無干擾。

3.4 提取方法的選擇

供試品溶液制備過程中，使用三氯甲烷超聲處理，結(jié)果含量偏低且平行樣品之間含量差異較大，后使用10 %草酸溶液、水飽和二氯甲烷，渦旋混勻，超聲處理進(jìn)行提取，離心取樣[1，9]，得到較好結(jié)果。

3.5 提取時間的選擇

對超聲提取的時間進(jìn)行了考察，比較了20，30，40 min，試驗結(jié)果表明，超聲30 min提取效果最好。