基于響應曲面優化的毛細管電泳測定通經草中的蘆丁和異槲皮苷

袁 哲 ，桑志國，孫 姍，呂元琦*

（1.濟南大學 山東省醫學科學院 醫學與生命科學學院，山東 濟南 250200；2.山東省醫學科學院 藥物研究所，山東 濟南 250062；3.國家衛生部生物技術藥物重點實驗室，山東省罕少見病重點實驗室，山東 濟南250062；4.德州學院分析測試中心，山東 德州 253023）

通經草又名銅絲草、金絲草等，是中國蕨科粉背蕨屬銀粉背蕨[Aleuri-topteris argentea(Gmel.) Fée]的干燥全草[1]，具有活血調經、止咳、利濕、解毒消腫等功效[2]，在我國藏族、蒙古族和朝鮮族等少數民族地區應用比較普遍。藥理研究證實通經草具有抗炎功效且其藥理作用主要與黃酮類組分有關[3]。蘆丁和異槲皮苷是通經草中兩種黃酮類活性成分[4]，準確測定通經草中的蘆丁和異槲皮苷對其質量控制有重要意義。毛細管電泳具有分析速度快，分辨率高和分析成本低等優點[5-6]，已成為發展較快的分析方法之一。響應曲面法（response surface method，RSM）采用多元二次回歸方程來擬合響應值與各因素間的函數關系[7-8]，將試驗體系的目標響應值作為單個或多個因素的函數，將函數關系通過立體或多維圖形顯示出來，結合圖形分析、函數求導等方法優化試驗條件。其具有試驗次數少、周期短、求得的回歸方程精度高等優點。本文采用RSM優化蘆丁和異槲皮苷的毛細管電泳分離條件，建立了一種毛細管電泳分析通經草中蘆丁和異槲皮苷的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

K1050高效毛細管電泳儀（北京凱奧），配有高壓電源和可變波長紫外檢測器；未涂層石英毛細管柱（河北永年光導纖維廠）；PHSJ-4A 酸度計（上海精密儀器公司）。

1.2 試藥

蘆丁（對照品，純度≥97 %，美國Sigma-Aldrich公司）；異槲皮苷（對照品，純度≥98 %，美國Sigma-Aldrich公司）；硼砂（純度≥99.5 %，美國Sigma-Aldrich公司）；硼酸（純度≥99.5 %，美國Sigma-Aldrich公司）；1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（BMIM-PF6，純度≥98 %，英國Alfa-Aesar公司）；其他試劑均為分析純，實驗用水為二次石英蒸餾水（DDW），不同產地通經草（購自河北安國中藥市場）。

2 方法

2.1 電泳條件

以pH 8.7的23 mmol/L硼砂-1.0 mol/L硼酸-5.34 mmoL/L BMIM-PF6為工作緩沖溶液，工作電壓18 kV，溫度25 ℃，壓差進樣（高度11.5 cm，進樣時間15 s），檢測波長354 nm。新毛細管使用前依次用DDW，1 mol/L NaOH，DDW和緩沖液依次沖洗30，30，15，15 min。每天實驗前，依次用DDW，1 mol/LNaOH，DDW和緩沖液沖洗15，15，10，10 min。為保證遷移時間和峰面積的重現性，每兩次進樣之間，分別用DDW，1 mol/LNaOH，DDW，緩沖液各沖洗5 min。所有溶液在進樣前，均經超聲脫氣5 min，上機前用0.22 μm醋酸纖維濾膜過濾。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 分別準確稱取蘆丁、異槲皮苷對照品各2.0 mg，用乙醇溶解至2 ml，得1 mg/ml蘆丁、異槲皮苷對照品母液。使用時用70 %（v/v）乙醇稀釋至所需濃度。

2.2.2 供試品溶液的制備 將通經草在陽光下曬干，60 ℃鼓風干燥6 h，粉碎，過80目篩。準確稱取樣品0.250 g，加70 %乙醇35 ml，超聲1 h，60 ℃水浴加熱30 min，醇沉過夜，濾過，取濾液，70 %乙醇定容至50 ml。

2.3 線性關系

以濃度（μg/ml）為橫坐標，分析物峰面積（mAU·s）為縱坐標，繪制標準曲線。結果表明蘆丁和異槲皮苷的濃度和峰面積分別在2～200，2～250 μg/ml范圍內線性關系良好，蘆丁和異槲皮苷線性回歸方程分別為：y=699.99x-29.106，R2=0.9999；y=1703.8x+76.602，R2=0.9996。

2.4 精密度實驗

取10 μg/ml混合對照品溶液，按2.1項條件進樣測定，連續測定5次，2種分析物遷移時間和峰面積的RSD分別為1.67 %，1.27 %和2.80 %，2.69 %。蘆丁和異槲皮苷基于3倍噪音法的檢出限分別為0.6，0.4 μg/ml。

2.5 單因素實驗

硼酸鹽緩沖體系常被用來分離黃酮類化合物，選擇硼砂緩沖溶液作為工作緩沖溶液。離子液體可提高毛細管電泳分離能力，本文選擇BMIMPF6離子液體作為添加劑。分別在pH 7.0～9.5、15～40 mmol/L、12～18 kV，1.47～7.28 mmol/L范圍內研究了緩沖溶液pH值、緩沖溶液濃度、工作電壓和離子液體BMIM-PF6濃度對分離的影響。綜合考慮分離度和分析時間，選擇緩沖溶液濃度為25 mmol/L，緩沖溶液pH為8.5，工作電壓為17 kV，離子液體BMIM-PF6濃度為6.31 mmol/L。最佳條件下分析物的分離情況見圖1，由圖1可見，蘆丁和異槲皮苷并未實現基線分離。

圖1 單因素實驗優化分離條件下混合對照品溶液毛細管電泳圖

2.6 RSM優化實驗結果

在單因素實驗結果的基礎上，以蘆丁與異槲皮苷的分離度R（Y）為響應值，選取對分離度影響顯著的4個因素即緩沖溶液pH（A）、工作電壓（B）、緩沖溶液濃度（C）和BMIM-PF6濃度（D），采用四因素三水平試驗設計進行Box-Behnken中心組合試驗，RSM設計因素水平及編碼見表1。

表1 RSM設計因素水平及編碼

根據表1的設計因素水平及編碼，利用Box-Behnken中心組合實驗原理進行試驗設計，設計方案及結果見表2。利用 Design-Expert 8.0 軟件對表2中數據進行二次多項式回歸擬合，得分離度R（Y）與各自變量的二次多元回歸方程Y=2.59-0.012A-0.0033B-0.0075C+0.0083D+0.27AB+0.023AC+0.0075AD+0.072BC+0.005BD+0.048CD-0.40A2-0.350B2-0.37C2-0.34D2，回歸方程分析見表3。

表2 RSM試驗設計方案與結果

由表3可見，模型有很高的顯著性（P＜0.0001）；失擬項P＞0.05，說明模型失擬度不顯著。R2=0.9896，表明所選取的模型相關度較好，可行性強。由F值可得各個因素對蘆丁與異槲皮苷分離度影響的大小順序：緩沖溶液pH（A）＞BMIM-PF6濃度（D）＞緩沖溶液濃度（C）＞工作電壓（B）。

采用Design-Expert 8.0軟件對緩沖溶液pH（A）、工作電壓（B）、緩沖溶液濃度（C）和BMIM-PF6濃度（D）各因子間的交互作用進行分析，結果見圖2。響應面三維圖不僅可解釋自變量之間的相互作用，也可反映變量間的相互作用。通過觀察曲面的彎曲度確定兩者對響應值的影響程度，彎曲度越高，即坡度越陡，說明兩者交互作用越顯著[9]。由圖2可見，緩沖溶液濃度（C）與BMIM-PF6濃度（D）兩因素交互作用的響應面較陡，表明緩沖溶液濃度（C）與BMIM-PF6濃度（D）兩因素交互作用顯著。

表3 回歸方程方差分析

圖2 各因素交互作用對蘆丁與異槲皮苷分離度影響的響應面分析

2.7 最佳分離條件及驗證實驗

采用Design-Expert 8.0軟件對極值進行求解分析，得最佳分離條件為pH 8.67，工作電壓17.72 kV，緩沖溶液濃度22.58 mmoL/L，BMIM-PF6濃度5.24 mmoL/L，分析物分離度的預測值為2.53。結合實際操作考慮，將分離條件調整為pH 8.7，工作電壓18 kV，緩沖溶液濃度23 mmoL/L，BMIMPF6濃度5.34 mmoL/L。制備混合對照品溶液3份，按該分析條件進行驗證試驗，以檢驗模型預測的準確度。結果蘆丁與異槲皮苷的分離度為2.49（RSD=1.3 %），與預測值的偏差較小，說明得到的回歸模型與實際情況擬合較好，優選的分離條件準確可靠，進一步驗證了該模型的可行性。該分離度亦明顯高于單變量優化所得值（R=0.93）。優化條件下，蘆丁和異槲皮苷的毛細管電泳分離圖見圖3。

圖3 RSM優化條件下混合對照品溶液毛細管電泳圖

2.8 準確度實驗

本研究中，所用樣品為傳統中藥，且產地較多，由于各地自然環境等客觀因素的存在，導致各地樣品的成分及含量有一定差異，給內標物的選取工作帶來了一定難度，因此本研究采用外標法進行定量。分別準確稱取蘆丁、異槲皮苷對照品各2.0 mg，用乙醇溶解至2 ml，得1 mg/ml蘆丁、異槲皮苷混合對照品溶液。向已知含量的湖北產通經草樣品中按0.1 mg/g加入混合對照品溶液，按2.1項條件進樣分析，結果見表4。由表4可見，兩種分析物的回收率在102.4 %～107.9 %之間，RSD（n=5）分別為4.3 %，4.7 %，表明該方法具有良好的準確度和可靠性。

表4 加標回收實驗結果（n=5）

2.9 實際樣品分析

精密稱取通經草樣品0.250 g，按2.2.2項方法制備供試液，按2.1項電泳條件對6個不同產地通經草中的蘆丁和異槲皮苷成分進行含量測定，結果見表5。由表5可見，6個產地通經草樣品中，蘆丁含量為0.154～0.272 mg/g，異槲皮苷含量為0.097～0.139 mg/g。

表5 不同產地通經草中蘆丁和異槲皮苷的含量（n=3）

3 結論

本實驗采用RSM優化了毛細管電泳分離分析通經草樣品中蘆丁和異槲皮苷的條件。所建方法簡便、快速、重現性良好，可為進一步開發和利用通經草中草藥資源提供一種有效的分析方法。