氣相色譜-質譜法測定食品中3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩的含量

□ 簡德威 熊含鴻 鄭悅珊 洪澤淳 陳科（通訊作者） 廣東省食品檢驗所

1 引言

3-乙 酰 基-2,5-二 甲 基 噻 吩（3-acetyl-2,5-dimethylthiophene，ADP）是一種可以作為咸味香精的食品添加劑，其于2002年開始被用作食品用香料，常用于肉類食品加工中以賦予食品烤堅果味[1]。2013年，歐洲食品安全管理局（EFSA）對ADP進行安全評估，發現該物質在體內和體外實驗均表現出基因毒性，會破壞DNA及細胞中的遺傳物質，可能損害人體健康，作為食品用香料使用存在安全隱患[2]，長期使用該物質存在食品安全問題和隱患，易導致食品安全事件（事故）發生。因此，EFSA將ADP從許可香料中剔除，并嚴禁ADP作為食用香料投放市場或用于食品[3，4]。同年6月14日，歐盟委員會也通過法規Regulation(EC)No 545/2013，禁止將ADP作為食品用香料使用。目前，我國仍允許ADP作為食品用合成香料使用，并收錄于國家標準GB 2760-2014[5]中。但是，中國香精香料化妝品工業協會于2013年8月14日發布自律文件(香化協字[2013]62號)，要求香料生產企業不得生產用作食品用香料的3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩，食用香精中不得使用該物質[6]。

目前，國內對3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩的檢測沒有相應的國家標準。查找相關文獻可發現，對ADP的檢測方法有液相色譜法[7]、氣相色譜-質譜法[8，9]及氣相色譜三重四級桿質譜法[10]等。液相色譜法的優點是分離效率高、檢測靈敏度高、應用范圍廣，缺點是定性效果差，容易受到雜質、基質等因素的干擾；氣相色譜-質譜法的優點是前處理簡單、操作方便、定性效果較好，但在復雜的基質樣品中，背景響應較高，致使檢測靈敏度降低；氣相色譜三重四級桿質譜法的優點是定性更準確、抗干擾能力強、樣品基質背景的響應較低、靈敏度也高于單級質譜，更適用于復雜基質中微量、痕量物質的檢測[11-13]，但氣相色譜三重四級桿質譜法操作較復雜，儀器較昂貴，技術難度較高。

考慮到食品基質復雜和檢測技術的難度，采用氣相色譜-質譜法測定3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩可以一定程度地避免受到雜質和基質的干擾，且定性效果好、定量準確、操作簡便、技術難度較低，因此本研究選擇氣相色譜-質譜法作為檢測方法。

表1 3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩參考保留時間及定性、定量離子

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

2.1.1 儀器設備

GCMS-QP2010Ultra氣相色譜-質譜聯用儀[配電子轟擊（EI）電離源]，日本島津公司；AB204-S電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；Multifuge X3R離心機，美國賽默飛世爾公司；KQ-500DE超聲清洗器，中國科橋公司；Vortex Genius 3渦旋混合器，德國IKA公司。

2.1.2 材料與試劑

正庚烷（色譜純），康科德科技有限公司；正己烷（色譜純），康科德科技有限公司；乙醇（色譜純），康科德科技有限公司；0.45μm有機濾膜，美國PALL公司；3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩標準品（純度99%），上海Aladdin公司。

2.2 實驗方法

2.2.1 標準溶液配制

2.2.1.1 3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩標準儲備溶液的配制

準確稱取3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩標準品20mg（精確至0.0001g），用正庚烷溶解并定容至10mL，此溶液濃度為2mg/mL。

2.2.1.2 3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩標準中間溶液的配制

將3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩標準儲備溶液(2.2.1.1)用正庚烷稀釋成濃度為20mg/L的標準工作溶液。

2.2.1.3 3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩標準系列工作液的配制

用正庚烷將標準中間溶液(2.2.1.2)稀釋成最終濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0mg/L的標準系列工作溶液。

2.2.2 前處理方法

稱取1.0g均勻樣品（精確至0.0001g）置于50mL離心管中，加入5mL正庚烷，超聲提取15min，5000r/min離心5min。然后將提取液轉至10mL容量瓶，殘渣用3mL正庚烷重復提取一次，合并所有提取液至10mL容量瓶，用正庚烷定容至10mL，過0.45μm有機濾膜，供氣相色譜-質譜聯用儀分析。

2.3 儀器條件

2.3.1 色譜條件

CP-wax：50m×0.25mm（內徑）×0.25μm（膜厚）極性毛細管色譜柱；載氣：He，純度99.999%，流速1.5mL/min；進樣口溫度：220℃；進樣方式：不分流進樣；進樣量：1μL；升溫程序：初始溫度50℃保持1min，以20℃/min升溫至200℃保持3 min，再以10℃/min升溫至220℃保持5min。

2.3.2 質譜條件

電子轟擊電離源（EI）；電離能量：70eV；接口溫度：225℃；離子源溫度：230℃；溶劑延遲時間：5min；測定方式：選擇離子監控（SIM）。3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩參考保留時間及定性、定量離子見表1，3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩的質譜圖及色譜圖見圖1、圖2。

圖1 3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩質譜圖

3 結果與分析

3.1 前處理條件的研究

3.1.1 萃取溶劑的研究

圖2 3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩色譜圖

表2 正己烷、正庚烷、乙醇作為萃取溶劑時的樣品回收率

日常檢驗檢測中，實驗室大多數使用的低毒萃取溶劑為正己烷、正庚烷、乙醇、異辛烷、二氯甲烷等。本方法選擇常用的正己烷、正庚烷、乙醇作為萃取溶劑，以超聲萃取方式測試不同基質加標樣品的回收率，考察3種溶劑的萃取效率，選擇效率最高的溶劑作為萃取試劑，結果見表2。

從表2的檢驗結果可以看出，使用正庚烷的萃取效率最高，回收率在88.5%～93.5%；其次是乙醇，回收率在79.3%～5.6%；正己烷的回收率最低，只有58.2%～60.5%。考慮到乙醇和水互溶，而帶入的水分可能會影響質譜性能，因此選擇正庚烷作為萃取溶劑。

3.1.2 萃取方法的研究

常用的萃取方法有超聲萃取、渦旋提取、索氏提取等，本方法采用超聲萃取、渦旋提取，使用正庚烷為萃取試劑，測試不同基質加標樣品的回收率，選取回收率最高的萃取方法作為本方法的最終萃取方法，結果見表3。

圖3 不同萃取時間段樣品的回收率

從表3的檢測結果可以看出，不同基質通過超聲萃取的回收率在90.8%～95.3%，均高于渦旋提取的回收率（85.2%～89.9%），因此選擇超聲萃取作為本方法的萃取方法。

3.1.3 萃取時間的研究

以正庚烷為萃取試劑，通過超聲萃取法，研究萃取1、5、10、15、20、30分鐘后不同基質加標樣品的回收率，結果見圖3。

從圖3可以看出，隨著萃取時間的增加，回收率結果呈現遞增趨勢，但萃取時間超過15分鐘后回收率無明顯變化，考慮到檢測方法的效率，故選取15分鐘作為本方法的萃取時間。

圖4 標準曲線圖

3.2 方法學驗證

3.2.1 標準曲線

通過標準溶液的配制與測定，得出本方法的標準曲線，見圖4。

以3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩在0.1～2.0mg/L內呈線性關系，線性回歸方程為Y=495019.8X-18840.62，相關系數R2＝0.997。

表3 超聲萃取、渦旋提取作為萃取方法時的樣品回收率

表4 不同基質計算出的檢出限和定量限結果表

表5 不同基質樣品加標6次重復測定結果表

3.2.2 方法檢出限與定量限

方法的檢出限以3倍信噪比（S/N）計算，定量限以3倍檢出限計算。通過測定不同基質的低加標含量，可計算出本方法的檢出限和定量限，結果見表4。

從表4結果可以看出，計算得到不同基質的檢出限分別為0.046、0.048、0.050mg/kg，因此將本方法的檢出限定為0.05mg/kg，定量限為0.15mg/kg。

3.2.3 準確性

通過對不同基質加標量為0.5mg/kg的含量測定，研究本方法的準確性，結果見表5。

從表5可以看出，加標量為0.5mg/kg的固體基質樣品，重復測定6次的平均值為0.47mg/kg，回收率為94.0%；加標量為0.5mg/kg的半固體基質樣品，重復測定6次的平均值為0.47mg/kg，回收率為94.0%；加標量為0.5mg/kg的液體基質樣品，重復測定6次的平均值為0.49mg/kg，回收率為98.0%，均符合GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》的要求[14]，說明本方法可準確定量樣品中3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩的含量。

3.2.4 重復性

通過對3種不同基質的不同濃度加標含量的測定，計算其回收率和相對標準偏差（RSD），研究本方法的重復性，結果見表6。

表6 不同基質樣品3種加標含量回收率結果表

從表6的結果中可以看出，固體基質低加標（0.3mg/kg）6次重復測定的回收率在83.6%～89.3%之間，RSD為2.45%；中加標（0.6mg/kg）6次重復測定的回收率在85.2%～91.7%之間，RSD為2.78%；高加標（1.0mg/kg）6次重復測定的回收率在87.1%～93.3%之間，RSD為2.87%。

半固體基質低加標（0.3mg/kg）6次重復測定的回收率在82.4%～90.2%，RSD為3.90%；中加標（0.6mg/kg）6次重復測定的回收率在86.1%～91.3%，RSD為2.20%；高加標（1.0mg/kg）6次重復測定的回收率在90.9%～100.8%，RSD為3.57%。

液體基質低加標（0.3mg/kg）6次重復測定的回收率在86.2%～94.8%之間，RSD為3.46%；中加標（0.6mg/kg）6次重復測定的回收率在86.7%～91.2%之間，RSD為1.74%；高加標（1.0mg/kg）6次重復測定的回收率在92.1%～101.3%之間，RSD為3.23%。

通過不同基質的不同濃度加標回收率及RSD可以看出，本方法滿足GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》的要求[14]。

4 結論

本研究建立了一種氣相色譜-質譜法測定食品中3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩含量的檢測方法。通過對萃取溶劑、萃取方法、萃取時間的研究，確定了較優且操作簡便的前處理條件，并對檢測方法的線性、檢出限、定量限、準確性、重復性進行方法學驗證，確保本方法的結果準確可靠。本研究建立的氣相色譜-質譜法測定食品中3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩含量的檢測方法，定性效果好、定量準確，且前處理操作簡便，技術難度較低，是對目前相對較少的3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩的檢測方法的補充，為建立3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩檢測的國家標準或方法提供參考依據，同時對執法部門進行食品加工和銷售過程中違規、違法添加化學原料行為的監管提供技術支持，避免食品安全事件發生，從而保障食品行業健康發展和人民舌尖上的安全。