茜素綠染料脫色菌株的篩選、鑒定及脫色研究

石 旭，陳棟梁，彭其安

茜素綠染料脫色菌株的篩選、鑒定及脫色研究

石 旭1,2，陳棟梁1,2，彭其安1,2*

（1. 武漢紡織大學 環境工程學院，湖北 武漢 430073；2. 武漢紡織大學 紡織印染清潔生產教育部工程研究中心，湖北 武漢 430200）

從活性污泥中分離到一株茜素綠脫色菌S-3，經16S rRNA基因測序分析，初步鑒定為兼性厭氧型菌弗氏檸檬酸桿菌。研究了該菌株對茜素綠染料的最適脫色條件。結果表明：菌株脫色的最佳培養基配方為胰蛋白胨1.2%、酵母浸粉0.5%、鹽濃度0.6%、pH=6.5。采用最優培養基在35℃，靜置培養48h后，對茜素綠含量為75mg/L的染液脫色率達92%，且染料廢水COD去除率與脫色率成顯著正相關關系（＜0.05）。

茜素綠；篩選；鑒定；生物脫色

印染廢水中含有大量的原染料，是印染廢水中的主要污染物。蒽醌染料具有色澤鮮艷、穩定、耐曬、牢度好等特點，是繼偶氮染料之后的第二大類染料。隨著偶氮染料禁用范圍擴大，蒽醌染料的重要性更加突出[1]。由于蒽醌染料母體骨架蒽醌兩邊的苯環同時受兩個羰基的影響，其結構非常穩定，與偶氮染料相比，處理蒽醌染料廢水更加困難。當前，傳統的物化處理技術存在著處理成本高、易引起二次污染，在工程應用中受到了一定制約。利用微生物技術處理色度高、難降解的染料廢水具有較好的應用前景，因其反應條件溫和、成本低廉、不產生二次污染等優勢，近年來越來越受學者們的關注[2-3]。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用富集培養基為LB培養基（g·L-1）：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0 g，pH7.0。平板分離培養基即LB培養基，加入15 g·L-1瓊脂粉。染料培養基即在富集培養基中加入一定濃度的茜素綠染料。活性污泥取自于武漢某印染公司廢水處理池，取回后添加一定濃度的染料再次富集培養二個月。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的篩選與鑒定

取1mL污泥上清液加入到100mL茜素綠培養基的三角瓶中（染料濃度50 mg·L-1），30℃培養。每4天更換新鮮的培養液，移取5 mL第一代富集培養液于100 mL新鮮富集培養基中，進行第二代富集，循環富集5代。取菌懸液于固體培養基上分離劃線，30℃培養24 h。選取不同形態的單一菌落接種到液體染料培養基中，30℃培養48 h，取上清液離心過濾，測試其脫色效果。將初篩得到脫色效果最佳的菌株接種到裝有20 mL 染料培養基的試管中，30 ℃培養48 h，測其脫色率。取復篩后脫色率最高的菌株進行活化傳代培養，轉接5代，30 ℃培養48 h，測定脫色率，選取最強脫色能力的菌株進行純化，保存備用。

將篩選出來的菌株送往上海派森諾生物科技有限公司，采用16S rDNA測序技術進行菌株鑒定。用Blast 軟件將拼接后的序列文件與 NCBI 16S rDNA數據庫中的數據進行比對，得到與待測物種序列相似性最大的物種信息，即為菌株初步鑒定結果。

1.2.2 脫色率的計算

取反應后的反應液10 mL，離心（8000 r/min）5 min，上清液過濾后在644 nm下測吸光度，記為At。以不接菌的含相同濃度染料的培養基的吸光度A0為對照，根據公式計算脫色率DE。

1.2.3 脫色優化

（1）培養基優化。篩選出高效脫色菌后，采用正交試驗法優化培養基。選取胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、pH為培養基優化因素，正交試驗表因素水平安排見表1。

表1 正交試驗設計

（2）培養條件優化。在最優培養基條件下，選取溶氧量、溫度、染料濃度等影響因素對染料脫色效果的影響，進行單因素實驗，優化培養條件。

（3）化學需氧量（COD）的測定。脫色前后的水樣送往澳實分析檢測（上海）有限公司，采用國標重鉻酸鉀法測定。

2 結果

2.1 菌株的篩選與鑒定

經分離篩選5株對茜素綠具有較好脫色能力的菌株，分別命名為S-1、S-2、S-3、S-4、S-5。其中，S-3菌株在相同時間內有最高脫色率，轉接5代，考察其脫色效果的穩定性，最終脫色效果如表2，分別命名為S-3.1、S-3.2、S-3.3、S-3.4、S-3.5、S-3.6。由表2可知，S-3.1菌株脫色率高，并且脫色效果穩定，因此，在后續實驗中選取脫色性能最好的S-3.1菌株作為試驗目標菌株。

表2 菌株脫色率

測序得到的序列在 NCBI數據庫中比對，選擇相似度最大的序列作為菌株初步鑒定結果。普遍研究認為，當16S rDNA序列同源性高于97%時，可以認為是屬內的同種[4]。脫色菌與弗氏檸檬酸桿菌的序列相似度為99%，該脫色菌初步鑒定為（弗氏檸檬酸桿菌）。

2.2 脫色優化

2.2.1 培養基優化

培養基是影響菌株生長的重要因素，也直接影響菌株對染料的脫色性能[5]。研究發現，在無外加培養基做碳源的情況下，菌株無法生長，菌株不能以茜素綠為唯一碳源進行代謝，染料的脫色與菌株的代謝相關[3]。在培養基的碳源、氮源不變的情況下，調整其濃度和pH后進行正交試驗，結果見表3。

經計算可得，最優培養配方為A3B2C1D1，即胰蛋白胨1.2%，酵母提取物0.5%，NaCl 0.6%，pH=6.5。由極差分析知，該影響菌種脫色效果的次序分別為：胰蛋白胨>NaCl>pH>酵母浸粉。

2.2.2 培養條件優化

（1）溶解氧和溫度對染料脫色影響

震蕩培養和靜置培養對菌株脫色效果具有顯著影響（見圖1）。在同一溫度下，當染料廢水含量為50mg/L時，搖床轉速為120 r·min-1，菌株脫色能力受到抑制；當溫度控制在25-35℃時，從脫色效果來看，該菌株在兼性厭氧條件下脫色效果更佳，說明該菌株為兼性厭氧菌，較充足的供氧反而影響到菌株的新陳代謝[6]。

溫度是影響染料脫色效果的關鍵因素之一[7]。一般認為，適合的溫度有助于微生物生長和代謝，但溫度過高也會抑制細菌生長，抑制了脫色菌活性，影響脫色效果[8]。本實驗在靜置培養時，脫色效果隨著溫度升高而增強，35℃時菌株脫色率高達87%。

表3 培養基正交試驗結果

圖1 不同培養條件對菌株脫色率影響

圖2 染料濃度對菌株脫色率影響

（2）染料濃度對菌株脫色的影響

一般認為，染料濃度越高時，毒性越大，影響脫色酶的活性[9]，脫色率隨之下降。本試驗菌株對染料廢水具有一定的抗逆特性，如圖2所示： 35℃條件下，隨著染料濃度越高（25-75 mg·L-1），脫色效率越好，當染料濃度達到75 mg·L-1時，菌株的脫色率高達92%。表明該菌對茜素綠染料廢水的抗逆特性良好。

（3）染料脫色率與COD去除關系

染料廢水中COD去除率是水質處理效果的重要指標之一。本研究中，盡管染料濃度越高，對菌株的毒害作用越強，但COD去除率缺越高，當染料濃度為75 mg·L-1時，COD去除率達到了19.5%（圖3）。統計分析結果表明，在三種染料濃度下，菌株對染料廢水的脫色率與COD去除率均顯著正相關（n=12，=0.647，<0.05）。

脫色時間（h）

3 討論

利用溫和條件下的微生物技術處理染料廢水，是水處理技術未來的發展趨勢和研究重點[10]。目前，蒽醌類染料脫色細菌為氣單胞菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬等；蒽醌類染料脫色真菌為青霉屬、紅酵母屬、曲霉屬、頭孢霉屬、栓菌屬、地霉屬等[11]。研究表明，真菌中的白腐菌分泌的漆酶對底物作用廣泛，能降解包括蒽醌染料在內的多種紡織染料，在印染廢水處理中具有一定應用前景[12]。有意思的是，純化后的漆酶對蒽醌染料脫色效果并不如粗酶，說明漆酶需借助其他小分子介質共同脫色，其脫色機理還需更深入研究[13]。本研究篩選出的蒽醌類染料茜素綠脫色菌屬于枸櫞酸桿菌屬()，該菌株不僅對茜素綠染料具有良好的脫色能力效果，還具備一定的降解能力。暗示了枸櫞酸桿菌屬脫色菌株具有較高的研究價值。

前人的研究表明，微生物脫色效率與營養物濃度、pH、溫度、溶氧、染料濃度等因素有關。本試驗也考慮了以上因素對茜素綠染料脫色影響，探索出較優的脫色條件，在此條件下，菌株對染料含量高達75 mg·L-1的廢水中脫色率達到了92%，經適當馴化后可應用于染料廢水脫色工藝中。本研究中，盡管菌株染料廢水脫色效果較好（高達92%），但COD的去除率仍有待進一步提高（不到20%），說明該反應體系中仍存在大量難降解的中間體。作者推測，在前期脫色中，受試菌株破壞了茜素綠染料的發光基團，該菌株尚缺乏徹底降解茜素綠染料能力，后期還需結合其他處理技術。

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Screening, Identification and Decolorization on Alizarin Green of a Decolorizing Bacteria

SHI Xu1, 2, CHEN Dong-liang1, 2, PENG Qi-an1,2

(1. College of Environmental Engineering, Wuhan Textile university, Wuhan Hubei 430073 China；2. Engineering Research Center for Clean Production of Textile Dyeing and Printing, Ministry of Education, Wuhan Textile University, Wuhan Hubei 430200, China）

A strain of alizarin green decolorization strain S-3 was isolated from activated sludge. According to 16s rRNA gene sequence analysis, the facultative anaerobes strain was identified as. The optimum decolorization conditions for alizarin green were studied. The results showed that the optimum medium for decolorization of the strain was peptone 1.2%, yeast extract 0.5%, salt concentration 0.6% and pH=6.5. The optimum culture medium was used at 35℃ for 48 hours. The decolorization rate of alizarin green dye solution of 75mg/L reached 92%. There was a positive correlation between the COD removal and the dye decolorization rate（<0.05）.

alizarin green; screening; identification; biodecolorization

，彭其安（1981-），男，講師，博士，研究方向：環境生物技術.

湖北省教育廳科學技術研究項目（B2018061）；武漢紡織大學技術研究院聯合開放課題（523010）；武漢紡織大學“環境工程與科學專業主干課程教學團隊”項目（201804）；湖北高校省級大學生創新創業訓練計劃項目（201810495098）.

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