秉前環毛蚓蚓激酶的提取及活性研究初報

2019-08-26 01:38:13林佳艷王文文唐梅

南方農業·上旬 2019年7期

林佳艷　王文文　唐梅

摘? ?要? ?蚓激酶是從蚯蚓體內提取的一組具有激酶和纖溶酶活性的蛋白質，能夠溶解血栓，具有很好的臨床應用價值。試驗采用硫酸銨粗提取的方法，從峨眉山大蚯蚓（秉前環毛蚓）體內提取蚓激酶粗提取物，測定其生物活性，并探討pH值、金屬離子及溫度對粗提物酶活性的影響。試驗結果表明：1）pH值、金屬離子及溫度對粗提物酶活性有影響。2）pH值在5～12，蚓激酶活性相對比較穩定，當pH=8時，酶活性達到最大值;3）Pb2+、Hg2+抑制酶活性;K+、Ca2+和Fe2+促進酶活性;4）當溫度在60 ℃以下時，酶活性較高且穩定性好;大于80 ℃時幾乎完全失活。

關鍵詞? ?峨眉山大蚯蚓;秉前環毛蚓;蚓激酶;酶活性;纖溶酶

中圖分類號：Q814? ? 文獻標志碼：A? ? DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.19.017

蚯蚓，又名地龍，屬環節動物門寡毛綱[1]。世界上蚯蚓大約有2 500種，入藥史長達四千年之久[2]。在中國醫藥學歷史上，蚯蚓可作為傳統中藥，具有降壓、利尿、清熱等作用。蚯蚓除作為傳統中藥外，還可從其體內提取活性物質，如蚓激酶、多種氨基酸等[3]。蚯蚓喜歡在潮濕陰暗、較疏松及腐殖質多的土壤中營穴居生活，通常晝伏夜出，能夠有效地躲避天敵[4]。

日本美原恒等從粉正蚓（Lumbricus rubellus）體內分離出一種具有溶纖作用的粗提物，并命名為蚓激酶[5]。蚓激酶具有激酶和纖溶酶活性，有溶解血栓作用，是目前世界上極具開發價值的纖溶類藥物。程牛亮[6]分離得到相對分子質量為36 000和29 000的兩種纖溶酶組分，能夠較好地溶解纖維蛋白及家兔血凝塊。鄧國寶等[7]發現蚓激酶具有良好的降低血糖、血脂功能。董強等[8]發現蚓激酶可用來治療和預防缺血性腦血管疾病。

峨眉山大蚯蚓，學名為秉前環毛蚓（Pheretima praepinguis），是峨眉山的特有種，主要分布在峨眉山的龍門洞（海拔約600 m）至萬年寺（海拔約1 000 m）[4]。峨眉山大蚯蚓肌肉很發達，伸縮能力強，可有效改善和凈化土壤。本試驗從峨眉山大蚯蚓體內提取蚓激酶粗提物，測定其生物活性，并探討pH值、金屬離子及溫度對粗提物酶活性的影響，為研發蚓激酶類藥物提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為峨眉山大蚯蚓（秉前環毛蚓），2017年7月在峨眉山報國寺、清音閣、萬年寺和洪椿坪一帶（海拔500～1 200 m）采得。峨眉山大蚯蚓先進行粗提，蚓激酶粗提物置-4 ℃恒溫箱中保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 蚓激酶粗提物的提取

提取蚓激酶工藝流程為[9]：原材料蚯蚓→多次水洗→稱重量→加入緩沖溶液→勻漿機勻漿→離心→取上清液加入硫酸銨→離心→上清液加入硫酸銨→高速離心→收集沉淀→透析去掉鹽→冷凍干燥凍干→蚯蚓粗制品。

1.2.2 蚓激酶粗提物濃度測定

測定蚓激酶粗提物濃度，采用考馬斯亮藍染色法測定蚓激酶溶液在波長為595 nm下測定其吸光度值[10]，得出濃度。標準曲線方程為y=0.006 9x+0.002 1，系數R2=0.988 3。詳見圖1。

1.2.3 蚓激酶粗提物的活性測定

蚓激酶粗提物活性的測定采用酶解雞血塊方法[11]。

1.2.4 蚓激酶粗提物pH穩定性測定及最適pH值

蚓激酶粗提物pH穩定性測定及最適pH值參考周海等的方法[12]。

1.2.5 測定各種金屬離子對蚓激酶粗提物活性的影響

測定各種金屬離子對蚓激酶粗提物活性的影響參考謝德芳的方法[2]。

1.2.6 蚓激酶粗提物熱穩定性以及最適溫度的測定

蚓激酶粗提物熱穩定性以及最適溫度的測定參考鄧志會的方法[13]。

2 結果與分析

2.1 蚓激酶粗提物的制備

本試驗新鮮峨眉山大蚯蚓的總用量為875.65 g，通過鹽析粗提、透析去鹽、冷凍干燥后得到蚓激酶粗提物7.18 g，蚓激酶的產率為0.82%，蚓激酶產率較低。由圖1可知，取1 mL蚓激酶液進行測定，得到吸光度值為0.365，由標準曲線方程可知蚓激酶液的濃度為52.6 μg·mL-1。

2.2 蚓激酶粗提物酶活性的檢測

由表1可知，第3組上清液蛋白質含量較第一、二組含量高。在雞血塊被酶解后，所含可溶性蛋白質含量明顯提高，由0.24%上升到0.62%。由此可知，蚓激酶粗提物具有酶活性，能夠酶解雞血塊使其蛋白含量增加。

2.3 蚓激酶粗提物的pH穩定性測定

混合液放置一段時間，進行活性測定，結果如圖2所示。當pH<3時，蚓激酶幾乎失去活性;在pH在5～12，蚓激酶活性相對比較穩定;在pH=8時，酶活性達到最大值;雖然在pH>9后，酶活性雖有所下降，但其活性相對仍較高;可見，蚓激酶在堿性環境，其活性相對較強。

2.4 金屬離子對蚓激酶的活性影響

由圖3可知，K+、Ca2+和Fe2+能夠提高蚓激酶活力;而Pb2+和Hg2+對酶活有抑制作用。金屬離子作為酶的激活劑還是抑制劑，主要取決于金屬離子與酶活性中心基團是否發生作用。若某一金屬離子能與酶某一活性中心基團作用結合，抑制酶發揮正常作用，如重金屬離子Pb2+、Hg2+就可以和酶活性中心的-SH作用而抑制酶活性。金屬離子如K+、Ca2+和Fe2+等對酶活性就起促進作用。

2.5 蚓激酶粗提物的熱穩定性及最適溫度的測定

將蚓激酶粗提物放在不同溫度水浴鍋保溫2 h后，測定蚓激酶活性。如圖4所示，蚓激酶粗提物在溫度60 ℃以下保溫2 h，其酶活性相對穩定，沒有顯著變化;但溫度高于60 ℃，蚓激酶活性發生變化，曲線呈下降趨勢，且斜率相對較大，說明酶活性下降速率較快;當溫度達到80 ℃以上時，蚓激酶幾乎完全失去活性。由此可知，蚓激酶具有很好的溫度穩定性，可以在常溫下進行提取和儲存。

3 結論與討論

遲玉杰等[14]研究表明，蚓激酶在pH=8.0時的活性最高。蚓激酶的最適溫度為57 ℃，熱穩定性好;蚓激酶其化學本質是蛋白質，強酸強堿能夠破壞蛋白質的穩定，使得蚓激酶失去了生物活性。

由試驗可知，在偏堿性條件下，蚓激酶的活性相對較強，pH值在5～12時，蚓激酶的活性都較強;pH=8.0時，蚓激酶的活性最高;pH<3蚓激酶幾乎完全失去活性。可見，蚓激酶具有較好的pH穩定性，能夠較好地適應堿性環境，如腸道堿性環境。若將蚓激酶加工成腸制劑，蚓激酶在腸道中可以保持較高的活性，發揮作用時間長，但是如果位于胃液較強酸性（pH值一般在0.9～1.5）環境中，蚓激酶失去活性，不能正常發揮作用。

金屬離子對蚓激酶的作用有所差別，K+、Ca2+和Fe2+能夠增強蚓激酶活力，起著激活劑作用;而Pb2+和Hg2+抑制酶活性，起著抑制劑作用，與遲玉杰等[14]研究結果相似。

劉美艷等[15]研究證明，在蚓激酶活性不被破壞的條件下，通過較長時間水浴保溫，蚓激酶活性仍能保持在50%以上。本試驗也表明蚓激酶粗提物的熱穩定性比較強，能夠較好的適應溫度的變化。因此，蚓激酶藥劑在室溫下能儲存。

蚓激酶有溶解血栓和防止血栓形成等作用，其應用前景廣闊，直接從蚯蚓中提取蚓激酶，量少且花費大，目前蚓激酶還沒有基因工程產品，后期可以利用基因工程技術進行蚓激酶基因的轉移及表達研究;為進一步研究純化、研究構效的關系，在增強或保持其催化活性的前提下通過對其某些特定氨基酸殘基的突變或是通過相關結構域的刪除、增加或融合等手段，以期提高對纖維蛋白的選擇性、提高對纖溶酶原激活劑、抑制劑的抗性，延長其在血液循環中的半衰期，導向溶栓、抗血栓形成等是今后蚓激酶的研究方向;同時為后期蚓激酶的開發和批量生產提供理論基礎。

參考文獻：

[1] 王承利，張賀，王洋.蚓激酶研究進展[J].沈陽部隊醫藥，2010，23（3）：200-202.

[2] 謝德芳.蚓激酶的分離純化、酶學性質及體外模擬消化的研究[D].武漢：武漢輕工大學，2013.

[3] 趙旭壯.蚯蚓中蚓激酶和復合氨基酸的提取分離純化及活力研究[D].成都：西華大學，2012.

[4] 唐梅，龔明福，唐波.峨眉山大蚯蚓生活環境的特點及其生態分布研究[J].科技資訊，2014，12（29）：247，249.

[5] Mihara H， Sumi H， Akazawa T， et a1. Fibrinolytic enzyme ex-tracted from the earthworm l Jl Fhromb Haemostas， 1983， 50： 258-263.

[6] 程牛亮.蚓激酶活性研究進展[J].中國實驗臨床免疫學雜志，1996，8（2）：8-11.

[7] 鄧國寶，劉媛莉，王石榮.蚓激酶對2型糖尿病胰島素抵抗及TNA-a影響的臨床研究[J].遼寧中醫藥大學學報，2007，9（3）：110-111.

[8] 董強，喬健，史郎峰，等.蚓激酶膠囊治療腦梗死患者的療效和安全性[J].中國新藥雜志，2004（3）：257-260.

[9] 馬闖，楊新力，楊麗萍，等.蚓激酶提取工藝的初步研究[J].山東食品發酵，2007（1）：3-4.

[10] 趙英永，戴云，崔秀明，等.考馬斯亮藍G-250染色法測定草烏中可溶性蛋白質含量[J].云南民族大學學報（自然科學版），2006（3）：235-237.

[11] 謝木林，章世元，王春維.蚓激酶粗提取條件的探討[J].飼料博覽，2010（3）：30-32.