不同預處理對菜蕨孢子萌發的影響

楊曦　蘇翠　蒙真鋮　陳鴻潔

摘? ?要? ?通過對菜蕨孢子的收集時間、貯藏方式、貯藏時間、接種前預處理、消毒滅菌、接種裝置等組織培養環節設置對比試驗，篩選出有利于提高孢子萌發率的預處理方式。結果表明：菜蕨孢子最佳收集期為7—9月;將收集到的孢子裝入離心管后置于4 ℃冰箱中貯藏，貯藏時間不超過1年的孢子都具有較高的活性;以4 ℃冰箱中貯藏3個月的孢子為外植體進行組織培養，用無菌水浸泡4 h，再用0.1%升汞消毒7 min，清洗3遍后接種于袋裝MS培養基中，菜蕨孢子萌發轉化為原葉體的數量最多。

關鍵詞? ? 菜蕨;孢子;原葉體;預處理;萌發

中圖分類號：Q943.1;S649? ? 文獻標志碼：A? ? DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.19.015

菜蕨[Callipteris esculenta （Retz.） J. Sm. ex Moore et Houlst]為蹄蓋蕨科（Athyriaceae）菜蕨屬（Callipteris）植物[1]，是滇東南地區深受群眾喜愛的食用蕨類之一。菜蕨在該地區食用歷史悠久，需求量大，但目前對食用蕨類資源的開發基本停留在采挖野生資源的原始模式，單純依靠菜蕨自然繁殖，其繁殖率低、生長周期長、種苗獲得率低，所得到的種苗不能滿足大規模人工種植的需求[2]。近幾年，雖然出現郭志友等對菜蕨進行組織培養與植株再生的研究報道，但是在用孢子為外植體進行誘導的過程中還是存在孢子萌發率極低的問題[3]。針對這一問題，本研究以菜蕨的成熟孢子為試驗對象，對孢子的貯藏時間、貯藏方式、接種前的預處理、消毒滅菌方式、接種裝置等因素開展比較試驗，篩選有利于提高孢子萌發率的方式，為加快食用蕨類植物規模化生產提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以成熟的菜蕨孢子或孢子囊為試驗材料。

1.2 試驗方法

試驗時間為2017年12月。

1.2.1 孢子收集、貯藏方式

收集菜蕨孢子時，應選用健壯、有成熟孢子囊群的菜蕨植株羽葉，及時將羽葉孢子或孢子囊刮下，放入50 mL直立離心管中，一種貯藏于4 ℃冰箱中;另一種在常溫下貯藏備用。將不同貯藏方式、不同貯藏時間的孢子（見表1），分別取0.02 g裝入備好的濾紙袋中編號，作為外植體進行常規消毒滅菌。常規消毒方法：0.1%升汞浸泡8 min→無菌水沖洗3次，接種到聚乙烯袋裝MS培養基上，光照強度為1 500 lx，每天光照10～12 h，培養溫度為（27±2）℃。重復3次，50 d后統計其成熟的原葉體數量。試驗數據用SPSS軟件進行統計分析。

1.2.2 接種前預處理

選用在4 ℃冰箱中貯藏3個月、18個月的菜蕨孢子，每個處理分別量取0.02 g，放入準備好的濾紙袋中作為外植體進行浸液處理，具體處理方式見表2，經過常規消毒滅菌后接種于袋裝MS培養基上，培養條件及常規消毒方法同上。觀察記錄每個處理最早萌發出原葉體的時間，并記錄萌發情況。

1.2.3 孢子的消毒滅菌

選用在4 ℃冰箱貯藏3個月的菜蕨孢子，分別量取0.02 g放入準備好的濾紙袋中，用無菌水浸泡3 h后，進行消毒滅菌。消毒方法采用組織培養上常用的0.1%升汞溶液浸泡消毒，浸泡時間分別為：3 min、5 min、7 min、10 min、15 min，無菌水沖洗3次后，分別接種到袋裝MS培養基中。每個消毒處理接種15袋，重復3次，培養條件同上，15 d后統計不同消毒時間的污染率，50 d后觀察孢子萌發情況。

1.2.4 接種方式

隨著組織培養技術的發展，近幾年在組織培養中多采用成本低廉、密封程度更好、體積小的一次性聚乙烯袋子代替傳統玻璃瓶作為分裝培養基的載體。試驗采用13 cm×14 cm的聚乙烯袋子與傳統玻璃瓶作對比，將4 ℃冰箱中貯藏3個月的菜蕨孢子，經4 h無菌水浸液處理、常規消毒滅菌后，分別接種到配方相同的MS袋裝培養基和傳統玻璃瓶容器MS培養基中，培養條件同上，50 d后觀察孢子萌發情況。

2 結果與分析

2.1 貯藏方式及時間對菜蕨孢子萌發的影響

試驗結果如圖1所示，在4 ℃冰箱中貯藏的菜蕨孢子萌發為成熟原葉體的數量明顯高于常溫貯藏。貯藏時間在3個月內的菜蕨孢子，隨貯藏時間增加，萌發量有一定量的增加，成熟原葉體均值最高可達128個，但貯藏6個月后的孢子整體萌發量下降比較顯著，特別是貯藏12個月后的孢子萌發數大幅度下降，常溫貯藏1年的菜蕨孢子萌發量極低，貯藏2年以后的孢子基本失活。試驗地處于熱帶季風氣候區，試驗開展時間為12月，雖然正值冬季，但相對溫暖濕潤，部分菜蕨配子體還長有極少量成熟孢子囊的羽葉，編號S1與編號S2的采集時間為冬季，孢子質量不佳，編號S3的孢子采集于孢子體羽葉生長旺盛期，成熟孢子囊最多，質量也最好，萌發為成熟原葉體的數量也最多。因此，選擇每年7—9月為孢子收集最佳時間，將收集到的孢子置于4 ℃冰箱中貯藏有助于保持孢子活性，能有效提高孢子萌發為原葉體的數量，但貯藏時間不宜過長，貯存期超過24個月的孢子已基本失活。

2.2 消毒滅菌前預處理對菜蕨孢子萌發的影響

試驗結果表明，在菜蕨孢子進行消毒滅菌前，將在4 ℃冰箱中貯藏3個月的孢子用無菌水或30 mg·L-1 GA3溶液浸泡4 h，可以提早孢子萌發時間，提高孢子萌發為原葉體的數量，對孢子萌發有較好的促進作用（見表3）。考慮到無菌水的經濟成本更低、操作簡單、更易獲得等優點，選用無菌水浸泡4 h為較佳的預處理方法。將在4 ℃冰箱貯藏18個月的孢子進行相同浸液處理，Y3、Y4與CK2相比，孢子萌發得到的原葉體數也有所提高，特別是Y4處理在提早萌發時間和提高萌發量上效果顯著，與翟國燕等[4]研究報道GA3對前一年的孢子萌發有促進作用的結果相一致。

2.3 不同消毒時間對菜蕨孢子萌發的影響

試驗結果表明（見表4），延長0.1%升汞消毒滅菌時間，有利于降低污染率，即消毒時間越久，污染率越低;當消毒時間達到15 min時，污染率最低，為2.23%。但消毒時間超過10 min時，孢子萌發為原葉體的數量就大幅度下降;當消毒時間達15 min時，消毒滅菌雖徹底，但對孢子的傷害也最明顯，即孢子無污染，也不萌發轉化為原葉體，基本失活。綜合污染率和萌發轉化為原葉體情況來看，菜蕨孢子的適宜消毒滅菌時間為7 min。

2.4 不同接種裝置對菜蕨孢子萌發的影響

由圖2可以看出，同一份孢子經浸液處理、消毒滅菌后分別接種到袋裝MS培養基和傳統瓶裝MS培養基中，在其配方、培養條件都相同的情況下，袋裝培養基中的孢子萌發更快，萌發轉化為原葉體的數量要遠遠高于瓶裝培養基。由于袋裝培養基密封性更好，能長期保持潮濕的小環境，且培養基表面呈不規則狀，與孢子的有效接觸面更大，比傳統瓶裝呈近平面的培養基更有利于菜蕨孢子吸脹及伸出假根，孢子壁開裂長出綠色細胞，再由綠色細胞分裂、分化形成肉眼可見的綠色心形狀的原葉體，符合陳維倫[5]等報道孢子在潮濕的環境中先吸脹，生出假根長出綠細胞，再發育轉化為綠色心形原葉體的萌發特性相一致。

3 小結與討論

郭志友等[6]對菜蕨配子體的發育特征進行研究，發現菜蕨孢子易失活與其生長在潮濕的河谷和沙灘等生境有關。要提高菜蕨孢子的萌發率，就要保證孢子盡量不失活。本研究通過對成熟菜蕨孢子的采集時間、貯藏方式、貯藏時間、接種前預處理、消毒滅菌、接種裝置等因素開展比較試驗，觀察記錄菜蕨孢子的萌發情況，篩選出適宜的菜蕨孢子貯藏、預處理、消毒、接種方式。生長在溫暖濕潤熱帶雨林地區的菜蕨，其孢子生長有明顯的季節性，孢子最佳收集期為7—9月;將收集到的孢子裝入離心管后置于4 ℃冰箱中貯藏，比常溫貯藏更有利于孢子活性的保持，能有效增加孢子萌發轉化為原葉體的數量，但貯藏時間不宜過長，不能超過1年;在選用4 ℃冰箱貯藏的孢子為外植體的組織培養過程中，用無菌水浸泡4 h，再用0.1%升汞消毒7 min，清洗3遍后接種于袋裝MS培養基中，是促進菜蕨孢子萌發轉化為原葉體的最佳方法，對發展菜蕨規模化生產具有現實意義，但成熟原葉體轉化生長為孢子體方面還需進一步研究。

參考文獻：

[1] 中國科學院植物志編委會.中國植物志（卷3，第2分冊）[M].北京：科學出版社，1999：475-479.

[2] 楊曦，蘇翠，孔得信，等.河口地區蕨菜產業發展思考[J].南方農業，2017（5）：40-43.

[3] 郭治友，俞筱押，羅應，等.菜蕨的組織培養與植株再生[J].植物生理學通訊，2010（1）：59-60.

[4] 翟國燕，邊珂，賈克功，等.GA3及不同比例MS培養基對蕨菜孢子萌發的影響[J].中國蔬菜，2007（8）：21-23.

[5] 陳維倫，郭東紅，石雷，等.蕨類植物的離體種質保存[A].紀念秦仁昌論文集[C].北京：中國林業出版社，1999：412-416.

[6] 郭志友，趙德剛.菜蕨配子體的形態特征研究[J].貴州農業科學，2012，40（10）：29-32.

（責任編輯：易? 婧）