不同預(yù)處理對(duì)菜蕨孢子萌發(fā)的影響

楊曦　蘇翠　蒙真鋮　陳鴻潔

摘? ?要? ?通過對(duì)菜蕨孢子的收集時(shí)間、貯藏方式、貯藏時(shí)間、接種前預(yù)處理、消毒滅菌、接種裝置等組織培養(yǎng)環(huán)節(jié)設(shè)置對(duì)比試驗(yàn)，篩選出有利于提高孢子萌發(fā)率的預(yù)處理方式。結(jié)果表明：菜蕨孢子最佳收集期為7—9月;將收集到的孢子裝入離心管后置于4 ℃冰箱中貯藏，貯藏時(shí)間不超過1年的孢子都具有較高的活性;以4 ℃冰箱中貯藏3個(gè)月的孢子為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，用無菌水浸泡4 h，再用0.1%升汞消毒7 min，清洗3遍后接種于袋裝MS培養(yǎng)基中，菜蕨孢子萌發(fā)轉(zhuǎn)化為原葉體的數(shù)量最多。

關(guān)鍵詞? ? 菜蕨;孢子;原葉體;預(yù)處理;萌發(fā)

中圖分類號(hào)：Q943.1;S649? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.19.015

菜蕨[Callipteris esculenta （Retz.） J. Sm. ex Moore et Houlst]為蹄蓋蕨科（Athyriaceae）菜蕨屬（Callipteris）植物[1]，是滇東南地區(qū)深受群眾喜愛的食用蕨類之一。菜蕨在該地區(qū)食用歷史悠久，需求量大，但目前對(duì)食用蕨類資源的開發(fā)基本停留在采挖野生資源的原始模式，單純依靠菜蕨自然繁殖，其繁殖率低、生長周期長、種苗獲得率低，所得到的種苗不能滿足大規(guī)模人工種植的需求[2]。近幾年，雖然出現(xiàn)郭志友等對(duì)菜蕨進(jìn)行組織培養(yǎng)與植株再生的研究報(bào)道，但是在用孢子為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)的過程中還是存在孢子萌發(fā)率極低的問題[3]。針對(duì)這一問題，本研究以菜蕨的成熟孢子為試驗(yàn)對(duì)象，對(duì)孢子的貯藏時(shí)間、貯藏方式、接種前的預(yù)處理、消毒滅菌方式、接種裝置等因素開展比較試驗(yàn)，篩選有利于提高孢子萌發(fā)率的方式，為加快食用蕨類植物規(guī)?；a(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以成熟的菜蕨孢子或孢子囊為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)時(shí)間為2017年12月。

1.2.1 孢子收集、貯藏方式

收集菜蕨孢子時(shí)，應(yīng)選用健壯、有成熟孢子囊群的菜蕨植株羽葉，及時(shí)將羽葉孢子或孢子囊刮下，放入50 mL直立離心管中，一種貯藏于4 ℃冰箱中;另一種在常溫下貯藏備用。將不同貯藏方式、不同貯藏時(shí)間的孢子（見表1），分別取0.02 g裝入備好的濾紙袋中編號(hào)，作為外植體進(jìn)行常規(guī)消毒滅菌。常規(guī)消毒方法：0.1%升汞浸泡8 min→無菌水沖洗3次，接種到聚乙烯袋裝MS培養(yǎng)基上，光照強(qiáng)度為1 500 lx，每天光照10～12 h，培養(yǎng)溫度為（27±2）℃。重復(fù)3次，50 d后統(tǒng)計(jì)其成熟的原葉體數(shù)量。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2 接種前預(yù)處理

選用在4 ℃冰箱中貯藏3個(gè)月、18個(gè)月的菜蕨孢子，每個(gè)處理分別量取0.02 g，放入準(zhǔn)備好的濾紙袋中作為外植體進(jìn)行浸液處理，具體處理方式見表2，經(jīng)過常規(guī)消毒滅菌后接種于袋裝MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件及常規(guī)消毒方法同上。觀察記錄每個(gè)處理最早萌發(fā)出原葉體的時(shí)間，并記錄萌發(fā)情況。

1.2.3 孢子的消毒滅菌

選用在4 ℃冰箱貯藏3個(gè)月的菜蕨孢子，分別量取0.02 g放入準(zhǔn)備好的濾紙袋中，用無菌水浸泡3 h后，進(jìn)行消毒滅菌。消毒方法采用組織培養(yǎng)上常用的0.1%升汞溶液浸泡消毒，浸泡時(shí)間分別為：3 min、5 min、7 min、10 min、15 min，無菌水沖洗3次后，分別接種到袋裝MS培養(yǎng)基中。每個(gè)消毒處理接種15袋，重復(fù)3次，培養(yǎng)條件同上，15 d后統(tǒng)計(jì)不同消毒時(shí)間的污染率，50 d后觀察孢子萌發(fā)情況。

1.2.4 接種方式

隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，近幾年在組織培養(yǎng)中多采用成本低廉、密封程度更好、體積小的一次性聚乙烯袋子代替?zhèn)鹘y(tǒng)玻璃瓶作為分裝培養(yǎng)基的載體。試驗(yàn)采用13 cm×14 cm的聚乙烯袋子與傳統(tǒng)玻璃瓶作對(duì)比，將4 ℃冰箱中貯藏3個(gè)月的菜蕨孢子，經(jīng)4 h無菌水浸液處理、常規(guī)消毒滅菌后，分別接種到配方相同的MS袋裝培養(yǎng)基和傳統(tǒng)玻璃瓶容器MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同上，50 d后觀察孢子萌發(fā)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏方式及時(shí)間對(duì)菜蕨孢子萌發(fā)的影響

試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，在4 ℃冰箱中貯藏的菜蕨孢子萌發(fā)為成熟原葉體的數(shù)量明顯高于常溫貯藏。貯藏時(shí)間在3個(gè)月內(nèi)的菜蕨孢子，隨貯藏時(shí)間增加，萌發(fā)量有一定量的增加，成熟原葉體均值最高可達(dá)128個(gè)，但貯藏6個(gè)月后的孢子整體萌發(fā)量下降比較顯著，特別是貯藏12個(gè)月后的孢子萌發(fā)數(shù)大幅度下降，常溫貯藏1年的菜蕨孢子萌發(fā)量極低，貯藏2年以后的孢子基本失活。試驗(yàn)地處于熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，試驗(yàn)開展時(shí)間為12月，雖然正值冬季，但相對(duì)溫暖濕潤，部分菜蕨配子體還長有極少量成熟孢子囊的羽葉，編號(hào)S1與編號(hào)S2的采集時(shí)間為冬季，孢子質(zhì)量不佳，編號(hào)S3的孢子采集于孢子體羽葉生長旺盛期，成熟孢子囊最多，質(zhì)量也最好，萌發(fā)為成熟原葉體的數(shù)量也最多。因此，選擇每年7—9月為孢子收集最佳時(shí)間，將收集到的孢子置于4 ℃冰箱中貯藏有助于保持孢子活性，能有效提高孢子萌發(fā)為原葉體的數(shù)量，但貯藏時(shí)間不宜過長，貯存期超過24個(gè)月的孢子已基本失活。

2.2 消毒滅菌前預(yù)處理對(duì)菜蕨孢子萌發(fā)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，在菜蕨孢子進(jìn)行消毒滅菌前，將在4 ℃冰箱中貯藏3個(gè)月的孢子用無菌水或30 mg·L-1 GA3溶液浸泡4 h，可以提早孢子萌發(fā)時(shí)間，提高孢子萌發(fā)為原葉體的數(shù)量，對(duì)孢子萌發(fā)有較好的促進(jìn)作用（見表3）?？紤]到無菌水的經(jīng)濟(jì)成本更低、操作簡(jiǎn)單、更易獲得等優(yōu)點(diǎn)，選用無菌水浸泡4 h為較佳的預(yù)處理方法。將在4 ℃冰箱貯藏18個(gè)月的孢子進(jìn)行相同浸液處理，Y3、Y4與CK2相比，孢子萌發(fā)得到的原葉體數(shù)也有所提高，特別是Y4處理在提早萌發(fā)時(shí)間和提高萌發(fā)量上效果顯著，與翟國燕等[4]研究報(bào)道GA3對(duì)前一年的孢子萌發(fā)有促進(jìn)作用的結(jié)果相一致。

2.3 不同消毒時(shí)間對(duì)菜蕨孢子萌發(fā)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明（見表4），延長0.1%升汞消毒滅菌時(shí)間，有利于降低污染率，即消毒時(shí)間越久，污染率越低;當(dāng)消毒時(shí)間達(dá)到15 min時(shí)，污染率最低，為2.23%。但消毒時(shí)間超過10 min時(shí)，孢子萌發(fā)為原葉體的數(shù)量就大幅度下降;當(dāng)消毒時(shí)間達(dá)15 min時(shí)，消毒滅菌雖徹底，但對(duì)孢子的傷害也最明顯，即孢子無污染，也不萌發(fā)轉(zhuǎn)化為原葉體，基本失活。綜合污染率和萌發(fā)轉(zhuǎn)化為原葉體情況來看，菜蕨孢子的適宜消毒滅菌時(shí)間為7 min。

2.4 不同接種裝置對(duì)菜蕨孢子萌發(fā)的影響

由圖2可以看出，同一份孢子經(jīng)浸液處理、消毒滅菌后分別接種到袋裝MS培養(yǎng)基和傳統(tǒng)瓶裝MS培養(yǎng)基中，在其配方、培養(yǎng)條件都相同的情況下，袋裝培養(yǎng)基中的孢子萌發(fā)更快，萌發(fā)轉(zhuǎn)化為原葉體的數(shù)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于瓶裝培養(yǎng)基。由于袋裝培養(yǎng)基密封性更好，能長期保持潮濕的小環(huán)境，且培養(yǎng)基表面呈不規(guī)則狀，與孢子的有效接觸面更大，比傳統(tǒng)瓶裝呈近平面的培養(yǎng)基更有利于菜蕨孢子吸脹及伸出假根，孢子壁開裂長出綠色細(xì)胞，再由綠色細(xì)胞分裂、分化形成肉眼可見的綠色心形狀的原葉體，符合陳維倫[5]等報(bào)道孢子在潮濕的環(huán)境中先吸脹，生出假根長出綠細(xì)胞，再發(fā)育轉(zhuǎn)化為綠色心形原葉體的萌發(fā)特性相一致。

3 小結(jié)與討論

郭志友等[6]對(duì)菜蕨配子體的發(fā)育特征進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)菜蕨孢子易失活與其生長在潮濕的河谷和沙灘等生境有關(guān)。要提高菜蕨孢子的萌發(fā)率，就要保證孢子盡量不失活。本研究通過對(duì)成熟菜蕨孢子的采集時(shí)間、貯藏方式、貯藏時(shí)間、接種前預(yù)處理、消毒滅菌、接種裝置等因素開展比較試驗(yàn)，觀察記錄菜蕨孢子的萌發(fā)情況，篩選出適宜的菜蕨孢子貯藏、預(yù)處理、消毒、接種方式。生長在溫暖濕潤熱帶雨林地區(qū)的菜蕨，其孢子生長有明顯的季節(jié)性，孢子最佳收集期為7—9月;將收集到的孢子裝入離心管后置于4 ℃冰箱中貯藏，比常溫貯藏更有利于孢子活性的保持，能有效增加孢子萌發(fā)轉(zhuǎn)化為原葉體的數(shù)量，但貯藏時(shí)間不宜過長，不能超過1年;在選用4 ℃冰箱貯藏的孢子為外植體的組織培養(yǎng)過程中，用無菌水浸泡4 h，再用0.1%升汞消毒7 min，清洗3遍后接種于袋裝MS培養(yǎng)基中，是促進(jìn)菜蕨孢子萌發(fā)轉(zhuǎn)化為原葉體的最佳方法，對(duì)發(fā)展菜蕨規(guī)?；a(chǎn)具有現(xiàn)實(shí)意義，但成熟原葉體轉(zhuǎn)化生長為孢子體方面還需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

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[5] 陳維倫，郭東紅，石雷，等.蕨類植物的離體種質(zhì)保存[A].紀(jì)念秦仁昌論文集[C].北京：中國林業(yè)出版社，1999：412-416.

[6] 郭志友，趙德剛.菜蕨配子體的形態(tài)特征研究[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（10）：29-32.

（責(zé)任編輯：易? 婧）