香蕉根結(jié)線蟲卵的分離與孵化試驗初報

李春　趙東興　張建春　李芹

摘? ?要? ?采用直接解剖分離法和粉碎篩分法分離香蕉根結(jié)線蟲，并利用濾液和蒸餾水（對照）在室溫和26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，研究香蕉根結(jié)線蟲卵的分離和孵化情況。結(jié)果表明：1）粉碎篩分法具有簡單、快速的特點，能較快獲取所需線蟲卵的懸浮液;2）26 ℃恒溫培養(yǎng)卵孵化率比室溫條件下孵化率高，且用濾液培養(yǎng)的卵孵化率高于蒸餾水培養(yǎng)的孵化率。3）在26 ℃恒溫條件下加入濾液和蒸餾水培養(yǎng)10 d，卵的孵化率分別為84.21%和58.36%;室溫條件下培養(yǎng)10 d，線蟲的孵化率分別為43.22%和27.55%。4）粉碎篩分法是一種較簡單的從香蕉根中分離得到根結(jié)線蟲卵的方法，且在26 ℃用濾液培養(yǎng)10 d能使多數(shù)線蟲卵孵化。

關(guān)鍵詞? ? 香蕉;根結(jié)線蟲卵;分離;孵化;粉碎篩分法

中圖分類號：S432.4+5;S668.1? ? 文獻標志碼：A? ? DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.19.012

香蕉根結(jié)線蟲?。∕eloidogyne incognita）是由根結(jié)線蟲屬（Meloidogyne spp.）的線蟲引起的，是為害香蕉的重要病害之一，各香蕉種植區(qū)均有發(fā)生，發(fā)病率一般為20%～30%，嚴重的達60%以上。香蕉被線蟲為害后，植株表現(xiàn)為葉黃、矮小，早衰，抽蕾困難，產(chǎn)量減少。有些蕉園由于根結(jié)線蟲的影響，有一半以上的香蕉樹不能結(jié)出有商品價值的果實[1-5]。根結(jié)線蟲的侵染導(dǎo)致香蕉嚴重減產(chǎn)，極大地影響了香蕉產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[6-7]。

目前，國內(nèi)外對香蕉根結(jié)線蟲的研究主要集中在防治方面[8-13]，而對于香蕉根結(jié)線蟲卵的分離與孵化研究較少，僅見劉志明等[14]研究了不同香蕉品種根滲出物對南方根結(jié)線蟲卵孵化的影響，但未涉及線蟲卵的分離。因此，有必要對香蕉根結(jié)線蟲卵的分離以及卵的孵化進行研究。本試驗采用直接解剖分離法和粉碎篩分法分離香蕉根結(jié)線蟲，并利用濾液和蒸餾水對照在室溫和26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，計算卵的孵化率，以期為香蕉根結(jié)線蟲的進一步研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 儀器

顯微鏡、體視鏡、3.5 cm培養(yǎng)皿、200目和500目標準分樣篩。

1.1.2 材料

試驗用香蕉根采自于云南省紅河熱帶農(nóng)業(yè)科學研究所香蕉種植基地。

1.2 試驗方法

1.2.1 香蕉根結(jié)線蟲卵的分離

1.2.1.1直接解剖分離法

將采集的香蕉根洗凈，選取帶根結(jié)病根在體視鏡下直接挑取線蟲卵粒。

1.2.1.2粉碎篩分法

將采集的香蕉根洗凈，收集帶根結(jié)病根，將病根剪成0.5～1.0 cm大小，置于植物粉碎機中粉碎，過濾，收集500目篩子中的卵，離心后配成300個卵/mL的根結(jié)線蟲卵懸浮液。

1.2.2 根結(jié)線蟲卵的孵化

在無菌培養(yǎng)皿（直徑為3.5 cm）中加入根結(jié)線蟲卵懸浮液0.2 mL，即線蟲卵約60個，再加入根結(jié)濾液0.8 mL，分別置于室溫和26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以蒸餾水為對照，每個處理重復(fù)3次。在0， 2， 4， 6， 8， 10 d時于顯微鏡下觀察培養(yǎng)皿內(nèi)孵化出的二齡幼蟲（J2）數(shù)，并計算線蟲孵化率。以上試驗重復(fù)3次。

線蟲孵化率（%）=孵化線蟲數(shù)/線蟲卵數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 香蕉根結(jié)線蟲卵的分離

根結(jié)線蟲卵的分離方法有直接解剖分離法、粉碎篩分法等。試驗對比了直接解剖分離法和粉碎篩分法2種方法分離線蟲卵的效果。直接解剖分離法能獲得較純凈的線蟲卵，但需在體視顯微鏡下操作，對操作者的技術(shù)熟練程度要求較大，且耗費大量的時間。通過查閱大量的文獻，參考王鑫鵬等[15]的辦法，將香蕉根洗凈，收集帶根結(jié)病根，將病根剪成0.5～1.0 cm大小，置于植物粉碎機中粉碎，過濾，收集500目篩子中的卵，離心后得到大量的線蟲卵。通過此法可簡單、快速分離得到試驗所需的線蟲卵。因此，試驗所需的線蟲卵均為此法獲得。

2.2 不同條件下香蕉根結(jié)線蟲卵的孵化率

根結(jié)線蟲具有親水性。在試驗的前期，發(fā)現(xiàn)根結(jié)線蟲在濾液中浸泡8 d后，還有大量線蟲活著，并且隨著時間增加，二齡線蟲的數(shù)量呈增加趨勢。因此，試驗研究濾液、培養(yǎng)溫度及蒸餾水培養(yǎng)對根結(jié)線蟲卵的孵化率影響，不同培養(yǎng)條件下香蕉根結(jié)線蟲卵的孵化率見表1。

從表1中可看出，在室溫條件下，加入濾液的線蟲卵孵化率10 d后達到43.22%，而蒸餾水對照的線蟲孵化率為27.35%;從時間上來看，與蒸餾水對照處理相比，在所記錄的各個時間，加入濾液的線蟲孵化率均比對照處理的孵化率高。

在26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，加入濾液線蟲卵孵化率10 d后達到84.21%，而蒸餾水對照的線蟲孵化率為58.36%;另外，與蒸餾水對照處理相比，在所記錄的各個時間，加入濾液的線蟲孵化率均比對照處理的孵化率高。

通過表1中的數(shù)據(jù)可以看出，恒溫培養(yǎng)的卵孵化率比室溫培養(yǎng)的卵孵化率高，這可能是因為溫度對卵的孵化有影響。南方根結(jié)線蟲是云南省河口地區(qū)香蕉根結(jié)線蟲的優(yōu)勢種群[16-17]，而南方根結(jié)線蟲的適宜孵化溫度為25～35 ℃。另外，加入濾液后，在26 ℃恒溫培養(yǎng)10 d，線蟲卵孵化率為84.21%，卵孵化率高出對照的25.85%，這是因為濾液是由香蕉根粉碎后沖洗過濾所得，里面可能中含有線蟲發(fā)育需要的營養(yǎng)成分。

3 小結(jié)與討論

試驗通過對比了直接解剖分離法和粉碎篩分法分離香蕉病根中根結(jié)線蟲的效果，結(jié)果為粉碎篩分法具有簡單、快速的特點，能較快獲取所需線蟲卵的懸浮液，可用于香蕉病根中線蟲卵的分離與富集。

試驗分別研究了室溫培養(yǎng)和26 ℃恒溫培養(yǎng)條件下用濾液培養(yǎng)和蒸餾水培養(yǎng)線蟲卵的孵化率。結(jié)果表明，在室溫條件或恒溫條件下，用濾液培養(yǎng)的卵孵化率高于蒸餾水培養(yǎng)的孵化率，室溫條件下培養(yǎng)10 d，線蟲的孵化率分別為43.22%和27.55%;26 ℃恒溫培養(yǎng)10 d，線蟲的孵化率分別為84.21%和58.36%。這可能是因為試驗是在2018年11月至2019年1月進行，空氣溫度較低，未達到線蟲卵的適宜孵化溫度造成的。據(jù)報道，云南省河口地區(qū)香蕉根結(jié)線蟲的優(yōu)勢種群為南方根結(jié)線蟲[16]，而離體條件下，南方根結(jié)線蟲的卵適宜孵化溫度為25～35 ℃，最適溫度為27 ℃和26 ℃[17]。另外，濾液培養(yǎng)的卵孵化率高于蒸餾水培養(yǎng)的孵化率，有可能是濾液由香蕉根粉碎后沖洗過濾所得，里面可能中含有線蟲發(fā)育需要的營養(yǎng)成分。

試驗通過研究香蕉根結(jié)線蟲的分離和培養(yǎng)，得到了簡單快速的線蟲卵分離和人工孵化方法，為香蕉根結(jié)線蟲的進一步研究提供了基礎(chǔ)。

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（責任編輯：敬廷桃）