牡蠣肽對腎陽虛大鼠下丘腦垂體甲狀腺軸調(diào)節(jié)作用的研究

李 亞,王 通,王廣飛,王運智,于雁飛,高永林,*

(1.煙臺嘉惠海洋生物科技有限公司,山東煙臺 264006; 2.煙臺大學生命科學學院,山東煙臺 264005)

牡蠣俗稱海蠣子、生蠔,是世界上養(yǎng)殖規(guī)模最大的貝類,也是我國四大養(yǎng)殖貝類之一,在我國沿海地區(qū)有廣泛的人工養(yǎng)殖[1]。牡蠣中營養(yǎng)物質(zhì)豐富,包括高含量的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì),氨基酸組成完善,富含維生素及各種微量元素,尤其是牛磺酸含量較高[2]。牡蠣藥食同源,不僅具有很高的食用價值,而且具有獨特的保健功能[3]。牡蠣肽是以牡蠣為原料,利用分子生物技術酶解加工后經(jīng)分離、純化、干燥等步驟制成的分子量較低的低聚肽混合物[4]。牡蠣肽近年來研究廣泛,牡蠣肽對機體有著抗氧化、抗高血壓、降血糖、提高免疫力、抗腫瘤、改善學習記憶等重要作用[5-7]。

腎陽虛是一種中醫(yī)名詞術語。腎陽虛證是中醫(yī)的基本證型之一[8],由于“腎陽虛衰,溫煦失職,氣化失權”所表現(xiàn)出的虛寒型證候,稱為腎陽虛證。機體腎陽虛證的形成與神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等多個系統(tǒng)緊密相關,是多系統(tǒng)和多器官功能的綜合表現(xiàn)[9]。腎陽虛證在下丘腦-垂體-靶腺(腎上腺皮質(zhì)、甲狀腺、性腺、胸腺)軸均有不同環(huán)節(jié)、不同程度的功能紊亂,且主要的發(fā)病環(huán)節(jié)在下丘腦(或更高級中樞)的調(diào)節(jié)功能紊亂[10]。腎陽虛的主要病機為甲減[11-12],甲狀腺功能低下在腎陽虛病機學上占有重要的地位[13]。腎陽虛的形成有先天遺傳的因素,也受后天膳食營養(yǎng)、環(huán)境因素、生理狀態(tài)、精神狀態(tài)、日常生活習慣以及某些疾病和治療的影響[14]。

動物機體在某些化學試劑的誘導下會出現(xiàn)內(nèi)源性代謝紊亂和失調(diào),導致機體出現(xiàn)病理和生理上的改變[15]。本實驗通過對大鼠肌肉注射氫化可的松建立大鼠腎陽虛模型,以大鼠下丘腦-垂體-甲狀腺軸中各激素水平的變化來判斷腎陽虛模型的建立,并在建立模型過程中對動物給予不同劑量牡蠣肽灌胃處理,通過測定血清中游離三碘甲狀腺原氨酸(T3)、游離Ⅲ磺甲狀腺原氨酸(T4)、促甲狀腺素(TSH)等激素水平及甲狀腺組織的病理變化,觀察牡蠣肽對腎陽虛大鼠的作用是否與改善下丘腦-垂體-甲狀腺軸的功能低下有關。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

健康SD大鼠 雄性,SPF級,9周齡,體重210～230 g,60只,由山東綠葉制藥有限公司實驗動物中心提供(動物許可號:魯20140002);飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供;牡蠣肽 煙臺嘉惠海洋生物科技有限公司(批號ML20180300205,肽含量為62.1%,平均分子量為480.37);氫化可的松注射液 天津金耀藥業(yè)有限公司;T3、T4、TSH酶聯(lián)免疫檢測試劑盒 上海超研生物科技有限公司;Trizol試劑 北京索萊寶科技有限公司;逆轉錄試劑盒 Thermo公司;其余所用試劑 均為分析純。

Multiskan MK3酶標儀 Thermo公司;CX31生物顯微鏡 日本奧林巴斯公司;TDL-40B臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;石蠟切片機 德國Leica公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設計 將60只SD雄性大鼠適應性喂養(yǎng)后隨機分為5組,即正常組、模型組、牡蠣肽300 mg/kg組、牡蠣肽150 mg/kg組、牡蠣肽75 mg/kg組。其中正常組不注射氫化可的松、不進行牡蠣肽灌胃、給予與牡蠣肽等體積的水;模型組以每天25 mg/kg劑量肌肉注射氫化可的松建立腎陽虛模型(成功建模的模型組動物表現(xiàn)為豎毛、采食飲水減少、活動減少、體重減輕,血清T3、T4含量降低、TSH水平升高);牡蠣肽組動物每天25 mg/kg劑量肌肉注射氫化可的松并灌胃給予相應劑量牡蠣肽(300、150、75 mg/kg)至實驗結束,實驗持續(xù)35 d。實驗期間各組大鼠正常進食、正常進水。

1.2.2 樣本采集 連續(xù)灌胃完畢,對各組大鼠進行麻醉,抽取腹主動脈血,以1200×g(4 ℃)轉速離心10 min,吸取上層血清分裝,-80 ℃冰箱保存。打開顱骨后分離出下丘腦組織和甲狀腺組織,甲狀腺用福爾馬林溶液固定保存,下丘腦使用液氮速凍。

1.2.3 血清T3、T4、TSH的檢測 采用ELISA法,嚴格按照試劑盒說明書進行操作,測定各組血清樣品中T3、T4、TSH的含量。

1.2.4 下丘腦促甲狀腺激素釋放激素(TRH)mRNA表達的檢測 采用Trizol法提取下丘腦總RNA[16],嚴格按照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄及擴增,實驗中TRH上游引物序列為5′-GCTGGCTCTGG CTTTGAT-3′,下游引物序列為5′-GCCGGACCT GAACATTCT-3′[17],測定出各組結果后,以正常組的TRH mRNA表達水平為100%參照,計算并得出其余各組的TRH mRNA相對表達水平。

1.2.5 甲狀腺病理學組織檢查 將甲狀腺組織常規(guī)切片,HE染色,顯微鏡下觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 大鼠血清 T3、T4、TSH水平

甲狀腺是調(diào)節(jié)機體生命活動的重要內(nèi)分泌腺體,甲狀腺能夠分泌甲狀腺激素(T3、T4)來促進機體的物質(zhì)代謝和能量代謝。甲狀腺功能受上游下丘腦和垂體的調(diào)節(jié),下丘腦釋放TRH并作用于垂體促進分泌促甲狀腺素(TSH),TSH進一步作用于甲狀腺促進甲狀腺激素的釋放,同時機體血液中甲狀腺激素濃度的升高可以通過負反饋調(diào)節(jié)抑制下丘腦TRH和垂體TSH的分泌,構成下丘腦-垂體-甲狀腺軸的自發(fā)性控制回路[18-19]。當出現(xiàn)腎陽虛時,下丘腦-垂體-甲狀腺軸功能受到影響從而導致相關激素的含量發(fā)生變化。本實驗研究發(fā)現(xiàn),腎陽虛模型組大鼠血清T3、T4水平均較正常組極顯著降低(p<0.01),血清TSH水平有極顯著升高(p<0.01)。研究結果與翟旭峰等[12]的報道一致。與腎陽虛模型組相比,牡蠣肽(300和150 mg/kg)在不同程度上提升了大鼠血清T3、T4水平、降低血清TSH水平(p<0.05)。各激素水平變化幅度與牡蠣肽灌胃劑量呈正相關(見圖1、圖2和圖3)。研究結果表明,牡蠣肽(300和150 mg/kg)明顯改善腎陽虛模型大鼠血清激素水平。

圖1 牡蠣肽對大鼠血清T3的影響Fig.1 Effect of oyster peptide on serum T3 level注:與正常組相比,**表示差異極顯著p<0.01; 與模型組相比,Δ表示差異顯著p<0.05, ΔΔ表示差異極顯著p<0.01;圖2～圖4同。

圖2 牡蠣肽對大鼠血清T4的影響Fig.2 Effect of oyster peptide on serum T4 level

圖3 牡蠣肽對大鼠血清TSH的影響Fig.3 Effect of oyster peptide on serum TSH level

2.2 大鼠下丘腦TRH mRNA表達

下丘腦所分泌的TRH是下丘腦合成及分泌的一種下丘腦激素,它可以促進垂體TSH的合成與分泌。同時,TRH的合成也受血液中甲狀腺激素的調(diào)節(jié)。TRH在丘腦-垂體-甲狀腺軸介導的腎陽虛病理過程中發(fā)揮重要作用,發(fā)生腎陽虛時下丘腦TRH水平降低。本實驗研究結果發(fā)現(xiàn),與正常組相比,腎陽虛模型組大鼠下丘腦TRH mRNA表達極顯著降低(p<0.01)。與閔友江等[17]的研究結果一致，與腎陽虛模型組相比,牡蠣肽組(300和150 mg/kg)大鼠下丘腦TRH mRNA表達水平有顯著性增加(p<0.05),且表現(xiàn)出一定的劑量依賴關系(見圖4)。研究結果表明,牡蠣肽(300和150 mg/kg)對腎陽虛模型大鼠下丘腦TRH mRNA表達有明顯改善作用。

圖4 牡蠣肽對大鼠下丘腦TRH mRNA表達的影響Fig.4 Effect of oyster peptide on hypothalamus TRH mRNA express

2.3 大鼠甲狀腺病理變化

由圖5可見,正常組動物甲狀腺病理組顯示,實質(zhì)內(nèi)為大量甲狀腺濾泡,濾泡壁由單層上皮圍成,形成雙層壁,少量的間質(zhì)(圖5A)。腎陽虛模型組動物甲狀腺組織中甲狀腺數(shù)量減少,且濾泡變得不清晰,充滿膠質(zhì),且數(shù)量也有所減少,濾泡大小不等,大量的炎性細胞浸潤(圖5B)。與模型組比較,牡蠣肽(300 mg/kg)組動物甲狀腺細胞數(shù)量有所增加,濾泡結構正常,界限較為整齊,與正常組較為接近(圖5C)。牡蠣肽其他組動物甲狀腺病變與模型組比較未見明顯改善。研究結果說明300 mg/kg劑量的牡蠣肽對改善甲狀腺的病變有明顯保護作用。

圖5 各組動物甲狀腺組織形態(tài)學觀察Fig.5 Histological observation of thyroid tissue

3 結論

腎陽虛證的主要發(fā)病環(huán)節(jié)為下丘腦功能紊亂,下丘腦-垂體-甲狀腺軸異常引起的一系類表現(xiàn)和腎陽虛證類似,因此甲狀腺軸的各激素水平可以間接反映腎陽虛證的狀態(tài)。本次實驗中,通過肌肉注射氫化可的松建立腎陽虛模型,并觀察牡蠣肽的干預作用。由牡蠣肽各組的激素水平變化和可以看出,牡蠣肽可顯著改善腎陽虛大鼠異常的T3、T4及TSH含量,并促進下丘腦TRH mRNA的表達,對甲狀腺組織也有較好的保護作用,且本次實驗中以300 mg/kg的劑量效果最好。本次實驗說明牡蠣肽可改善腎陽虛模型大鼠的血清激素水平及下丘腦TRH mRNA的表達,可預防甲狀腺病理變化,對改善腎陽虛證有明顯的效果;其效果與調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-甲狀腺軸的內(nèi)分泌功能有關,且在基因表達的水平上參與了調(diào)節(jié)。