藻藍蛋白對非小細胞肺癌H1299生長、遷移和凋亡的功能影響

李 爽,郝 帥,王 靜,閆 燕,趙 磊,吳婷婷,王成濤

(北京工商大學食品學院,北京食品營養與人類健康高精尖創新中心, 北京市食品添加劑工程技術研究中心,北京 100048)

肺癌是全球發病率較高的一類惡性腫瘤,在腫瘤引起的死亡中占據首位,尤其在歐美一些發達國家男性惡性腫瘤中,肺癌的發生率更是長年維持在較高的水平[1]。在我國,肺癌也是發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。隨著工業化速度加快、環境污染加重、人口老齡化加劇,包括肺癌在內的腫瘤負擔日益加重[2]。由于傳統的腫瘤治療手段例如化學療法、放射性療法均存在潛在的健康風險,尋找一種具有抗癌功效的安全性天然物質已經成為研究熱點,其中藻藍蛋白近年來越來越受到研究人員的關注。

藻藍蛋白(C-phycocyanin,C-PC)源于螺旋藻、藍藻等海洋生物,是一種具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤活性的色素蛋白復合物[3],由開鏈四吡咯化合物和脫輔蛋白通過硫鏈鍵結合形成,在藻體中擔任能量的傳遞和貯存功能[4-5]。在2014年我國發布的《GB2760-2014食品安全國家標準食品添加劑使用標準》中,已經明確了藻藍蛋白可以作為天然食品著色劑運用于飲料、糖果、糕點等多種食品行業中。除此之外,藻藍蛋白還具有非常優良的生物學活性,包括抗炎、抗氧化、保肝、抗腫瘤等。因此,對藻藍蛋白功能特性的探索已經成為目前研究的熱點之一[6]。

藻藍蛋白的抗腫瘤功能在結腸癌[7]、乳腺癌[8-9]、胰腺癌[10-11]、宮頸癌[12]、卵巢癌[13]、喉癌[14]、白血病[15]、肝癌[16]等細胞系中已得到驗證,但對于其在肺癌中的報道并不多。肺癌病理分型按組織學可分為非小細胞肺癌(non-small cell carcinoma,NSCLC)和小細胞肺癌(Small cell carcinoma,SCLC)兩大類。非小細胞肺癌約占臨床診斷的85%,且轉移率高、治愈率極低。因此,探究藻藍蛋白對非小細胞肺癌的抗癌功能和潛在機制有著重要意義。Li[17]、Bingula[18]等人研究了藻藍蛋白和其他功能物質協同作用肺癌A549細胞并探究了其對細胞增殖凋亡的影響。本研究團隊前期也證實了藻藍蛋白能夠顯著抑制A549細胞的體外增殖和遷移能力[19]。為了更加深入和全面地了解藻藍蛋白在多種非小細胞肺癌中的功能,本研究以一株典型肺癌細胞系H1299為模型,對藻藍蛋白處理后的H1299細胞進行了體外增殖、遷移、細胞凋亡和細胞周期等方面的研究,以期為進一步開發功能食品奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人類非小細胞肺癌H1299細胞系 由本實驗室自主保存;純品藻藍蛋白 由內蒙古農業大學惠贈;1%青霉素-鏈霉素、吉姆薩染液 美國Corning公司;DMEM細胞培養基、培養皿、96孔板、6孔板 美國Gibco公司;特級胎牛血清 天津康源生物技術公司;AnnexinV/7-AAD染色試劑盒、脫脂奶粉 美國BD公司;RT-PCR相關試劑 天根生物技術有限公司;兔抗Bax單克隆抗體、兔抗Bad單克隆抗體、兔抗Bcl-2單克隆抗體、小鼠抗Bcl-xL單克隆抗體、小鼠抗β-Actin單克隆抗體 美國Cell Signaling Technology公司;RIPA細胞裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑、雜交袋 北京鼎國昌盛生物技術有限公司;Western Blot化學發光液、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜 美國Millipore公司。

BioSpectrum型化學發光成像儀 美國UVP公司;超凈工作臺 上海博訊醫療生物儀器股份有限公司;渦旋振蕩器 德國IKA公司;BSLTEP-A-224S型數字電子天平 Sartorius公司;CFX96Touch型熒光定量PCR檢測系統 美國Bio-Rad公司;SpectraMaxi3型連續波長多功能酶標儀 美國MD公司;FACSJAZZ型流式細胞儀 美國BD公司;Galaxy 170S恒溫CO2細胞培養箱 德國Heraeus公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 人類肺癌H1299細胞采用10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素DMEM培養基培養。細胞培養箱環境為37 ℃、5% CO2。使細胞貼壁生長,每隔2～3 d傳代,確保實驗的細胞處于對數生長期。

1.2.2 MTT法測定細胞活力 收集處于對數生長期的細胞,胰酶消化,以每孔5000個細胞量鋪于96孔板中,放置37 ℃恒溫恒濕培養箱中培養12 h,分別加入終濃度為0、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6 μmol/L(質量濃度分別為0、20、40、80、160、320 mg/L)的純品藻藍蛋白,繼續放置培養箱分別培養48、72 h后,加入10 μL MTT溶液(儲備液濃度為5 mg/mL)孵育4 h,加入100 μL SDS-HCl 裂解液(10% SDS-濃HCl 裂解液)繼續孵育12 h,檢測570 nm波長處吸光度A,統計數據并根據下式計算藻藍蛋白作用細胞48、72 h的細胞存活率R,其中0 μmol/L藻藍蛋白添加孔設置為對照組,存活率計算公式如下:

細胞存活率R(%)=[(A實驗組-A對照組)/A對照組]×100

1.2.3 細胞生長曲線測定 將處于對數生長期的細胞接種于96孔板(5×104/孔)12～16 h,細胞貼壁生長后分別添加終濃度為0、4.8 μmol/L藻藍蛋白處理,并加入10 μL的MTT(儲備液濃度為5 mg/mL),4～6 h后加入100 μL的SDS-HCl裂解液(10% SDS-0.01N HCl 裂解液),12 h后測量570 nm波長處吸光度,其中0 μmol/L藻藍蛋白添加孔設置為對照組。連續測定7 d,以時間為橫坐標,吸光度值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.2.4 克隆形成實驗檢測細胞集落形成能力 取對數期細胞接種于6孔板(2×102/孔),置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h待細胞完全貼壁,隨后分別采用濃度為0、2.4和4.8 μmol/L的藻藍蛋白處理細胞。培養2～3周,當6孔板中形成大約50個克隆數時終止培養,并用吉姆薩染液染色計算克隆數。其中0 μmol/L藻藍蛋白處理組為對照組。

1.2.5 流式細胞術測定H1299細胞周期分布及其相關基因檢測 取對數生長期細胞接種在T25的培養瓶中37 ℃過夜培養12～16 h。第2 d給細胞換液,加入藻藍蛋白使其終濃度分別為0、2.4和4.8 μmol/L,置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養48 h。胰酶消化1000 r/min室溫離心10 min收集細胞沉淀,PBS洗兩次,用200 μL PBS重懸細胞,用1 mL注射器將細胞均勻緩慢的打到4 ℃預冷的70%乙醇中,盡量使細胞單個分散,4 ℃固定24 h以上。收集固定的細胞,用4 ℃預冷的PBS洗細胞兩次,洗凈殘留的70%乙醇然后用500 μL PBS重懸細胞并轉移到1.5 mL離心管中,在每個樣品中添加終濃度為50 μg/mL的RNA酶,37 ℃消化40 min,之后加入碘化丙啶(PI)4 ℃避光染色30 min上機檢測各個細胞周期時相的變化情況。其中0 μmol/L藻藍蛋白處理組為對照組。

1.2.6 流式細胞儀檢測肺癌H1299細胞的早期、晚期凋亡 取生長狀態良好的細胞接種在T25培養瓶中培養24 h,分別加入0、2.4和4.8 μmol/L的藻藍蛋白處理72 h,胰酶消化后在室溫1000 r/min心10 min,用100 μL雙染孵育液將洗干凈的細胞沉淀重懸,加入5 μL AnnexinV-FITC染液,再加入5 μL 7-AAD染液,冰上20 min避光染色。充分混勻后上機檢測細胞的凋亡情況,統計早期凋亡、晚期凋亡的細胞比例。其中0 μmol/L藻藍蛋白處理組為對照組。

1.2.7 劃痕修復實驗檢測細胞的遷移率 將對數期細胞接種于培養皿中,底部預先用記號筆畫出三條平行線作為參考坐標,37 ℃、5% CO2培養至幾乎100%匯合度。用吸頭快速垂直于培養皿底部劃出一道直線,用培養基輕輕沖洗除去細胞碎片,加入含有0、2.4和4.8 μmol/L藻藍蛋白的新鮮培養基培養。分別在0、24和48 h在固定的劃痕位置進行拍照,測量劃痕區的寬度H并計算細胞的遷移率I,其中0 μmol/L藻藍蛋白處理組為對照組,遷移率計算公式如下:

I(%)=[(H實驗組-H對照組)/H對照組]×100

1.2.8 qRT-PCR檢測細胞周期、凋亡相關基因表達 將H1299細胞接種在60 mm的培養皿中,37℃恒溫恒濕培養箱過夜12 h使細胞貼壁生長,第2 d加入藻藍蛋白處理48 h,收集細胞。利用TRIZOL法提取細胞總RNA并使用NanoDrop測定 RNA 濃度,利用反轉錄試劑盒進行 cDNA 合成。熒光定量PCR采用三步法。所使用的擴增引物序列如表1所示。

表1 用于qRT-PCR分析的引物序列Table 1 Primer sequences used for qRT-PCR

1.2.9 Western blot檢測蛋白表達 將對數期細胞接種在培養皿中,培養24 h使細胞貼壁生長,第2 d加入藻藍蛋白處理48 h,收集細胞。利用RIPA裂解液提取細胞全蛋白,利用Bradford法測定蛋白濃度。取50 μg等質量蛋白上樣,通過12%的SDS-PAGE對蛋白進行分離,濃縮膠采用80 V電壓,30 min電泳條件,分離膠采用120 v,1.5 h電泳條件,直至溴酚藍跑至分離膠前沿時停止,取出分離膠進行轉膜,350 mA 恒流轉膜1.5 h,對目的蛋白條帶切割,室溫條件下采用5%的脫脂奶粉封閉1.5 h,加入一抗(稀釋比例為1∶1000)4 ℃孵育12～16 h,隨后37 ℃孵育二抗(稀釋比例為1∶5000)1 h,最后對蛋白條帶孵育發光液,收集化學發光信號進行曝光得到結果。

1.3 數據處理

柱狀圖和折線圖中的實驗數據均以平均數±標準差(Mean±Standard deviation)表示,采用SPSS 11.0 軟件進行單因素方差分析,其中p<0.05為顯著性差異(*);p<0.01為極顯著差異(**)。

2 結果與分析

2.1 藻藍蛋白對H1299細胞生長的影響

2.1.1 H1299細胞存活率和生長曲線的測定 圖1顯示,用不同劑量藻藍蛋白分別處理肺癌H1299細胞48和72 h,細胞存活率均出現了顯著或極顯著降低(p<0.05或p<0.01);同時,在同一作用時間下,隨著藻藍蛋白濃度的提高,細胞存活率也顯著下降(p<0.05或p<0.01)。在MTT法檢測細胞存活力實驗中,由于需要觀察不同濃度梯度下的存活率,選擇了多個濃度進行試驗(0、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6 μmol/L),而生長曲線是對存活率的進一步驗證,因此挑選了一個具有代表性的濃度(4.8 μmol/L)進行了實驗，進一步檢測藻藍蛋白對H1299細胞生長的影響。由圖2可知,實驗組從第3 d開始生長受到顯著抑制,第4 d以后受到極顯著抑制,細胞數量極顯著低于對照組(p<0.01)。以上結果表明,藻藍蛋白對肺癌H1299細胞的生長在一定程度上有抑制作用。

圖1 藻藍蛋白對肺癌H1299細胞活力的影響Fig.1 Effect of C-phycocyanin on the viability of lung cancer H1299 cells注:* 與對照組相比差異顯著(p<0.05);** 與對照組相比差異極顯著(p<0.01)；A:48 h;B:72 h；圖2～圖4同。

圖2 藻藍蛋白對肺癌H1299細胞生長的影響Fig.2 Effects of C-phycocyanin on the proliferation of lung cancer H1299 cells

2.1.2 藻藍蛋白對H1299細胞集落形成能力的影響 細胞周期、細胞凋亡、細胞集落實驗、細胞遷移實驗中我們均統一調整成了三個具有代表性的濃度(0、2.4、4.8 μmol/L)進行實驗,從圖3可知,隨著藻藍蛋白濃度的增加,細胞集落個數越來越少,與對照組相比出現顯著性差異(p<0.05)。由此可知,藻藍蛋白對H1299細胞集落形成能力有顯著抑制作用。

圖3 藻藍蛋白對H1299細胞集落形成能力的影響Fig.3 Effect of C-phycocyanin on colony forming ability of lung cancer H1299 cells

2.1.3 H1299細胞的周期分布及其相關基因的檢測 采用流式細胞術研究了藻藍蛋白處理對細胞周期的影響。由圖4可知,與對照組相比,藻藍蛋白處理組G1期細胞數量極顯著減少(p<0.01),S期細胞數量極顯著增加(p<0.01),表明細胞周期阻滯在了S期。隨后利用熒光定量PCR進一步檢測了周期相關基因的表達。周期蛋白家族和周期蛋白依賴激酶(cyclin-dependent kinase,Cdk)家族在周期運轉調控中起重要作用。Cdk與周期蛋白結合形成異源二聚體的復合物,具有蛋白激酶活性[20]。CyclinA與CDK2結合共同調控細胞S期向G2期的轉換,同時周期抑制因子P21、P27作用于CDKs,使細胞阻滯在S期[21]。流式細胞術結果顯示0、2.4、4.8 μmol/L濃度的藻藍蛋白使H1299細胞周期阻滯在S期,為了進一步驗證藻藍蛋白對周期基因的調控,我們進一步選取阻滯效果最好的4.8 μmol/L濃度藻藍蛋白作用的細胞進行定量PCR的檢測。圖5結果顯示,與對照組相比,實驗組細胞中p27、cdk2顯著下調(p<0.05),cyclinA極顯著下調(p<0.01),同時周期抑制因子p21極顯著上調(p<0.01),這些基因的改變可能使得細胞無法正常進入G2期,這與細胞周期的結果是一致的。

圖5 藻藍蛋白影響肺癌H1299細胞周期相關基因表達Fig.5 Effect of C-phycocyanin on the expression of cell cycle related genes in H1299 cells

2.2 藻藍蛋白對H1299細胞凋亡的影響

采用流式細胞術對藻藍蛋白處理后的H1299細胞的凋亡程度進行了檢測。細胞在凋亡啟動早期階段時,細胞中的磷脂酰絲氨酸會由細胞內向細胞外發生翻轉,能夠與Annexin-V特異性地結合,但細胞膜并沒有發生破裂,因此FITC熒光出現陽性信號,7-AAD出現陰性信號;而細胞在晚期凋亡時,細胞膜發生裂解,7-AAD能夠進入細胞與DNA結合,因此FITC和7-AAD均出現陽性信號。由圖6可知,與對照組相比,2.4 μmol/L藻藍蛋白濃度處理的細胞早期凋亡比例(2.01%±0.36%)和晚期凋亡比例(4.53%±0.21%)均出現顯著或極顯著增加(p<0.05或p<0.01);隨著處理濃度的增加,4.8 μmol/L藻藍蛋白處理后,早期(2.55%±0.32%)和晚期(11.3%±0.16%)凋亡細胞的比例也出現顯著或極顯著增多(p<0.05或p<0.01)。以上實驗結果表明藻藍蛋白對肺癌H1299細胞有促凋亡作用。

圖6 藻藍蛋白對肺癌H1299細胞凋亡的影響Fig.6 Effect of phycocyanin on the apoptosis of lung cancer H1299 cells

流式細胞術結果顯示0、2.4、4.8 μmol/L濃度的藻藍蛋白使H1299細胞出現濃度依賴性凋亡,為了進一步驗證藻藍蛋白對促、抑凋亡基因和蛋白的調控,我們進一步選取凋亡效果最好的4.8 μmol/L濃度藻藍蛋白作用的細胞進行定量PCR和Western Blot的檢測。采用4.8 μmol/L藻藍蛋白濃度處理細胞后,對凋亡相關基因和蛋白分別進行了定量PCR和Western Blot檢測。圖7和圖8結果顯示，藻藍蛋白處理后，促凋亡基因bcl-w、bad、bax以及bid的轉錄和蛋白水平顯著上調(p<0.05)，bak、bim極顯著上調(p<0.01)，抑凋亡基因bcl-xL則出現顯著下調(p<0.05)，bcl-2極顯著下調(p<0.01)。此結果與流式細胞術的凋亡實驗相一致。

圖7 藻藍蛋白影響肺癌H1299細胞凋亡相關基因的表達Fig.7 Effect of phycocyanin on the expression of apoptosis-related genes in lung cancer H1299 cells

圖8 藻藍蛋白影響肺癌H1299細胞凋亡相關蛋白的表達Fig.8 Effect of C-phycocyanin on the expression of apoptosis-related proteins in H1299 cells

2.3 藻藍蛋白對H1299體外遷移能力的影響

采用體外劃痕修復實驗研究了藻藍蛋白對肺癌H1299細胞體外遷移的影響。由圖9可知,隨著處理濃度的增加,細胞遷移率逐漸降低。藻藍蛋白作用48 h時,2.4和4.8 μmol/L處理量下的細胞遷移率分別為56.3%±2.35%與33.5%±1.22%。此結果表明,藻藍蛋白能夠顯著抑制H1299細胞的體遷移能力。

圖9 藻藍蛋白對肺癌H1299體外遷移能力的影響Fig.9 Effect of C-phycocyanin on the in vitro migration of lung cancer H1299 cells

隨后利用Western Blot檢測了4.8 μmol/L藻藍蛋白處理后的H1299細胞內基質金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的水平。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是細胞遷移過程中重要的蛋白酶,是調節細胞外基質生長的重要系統,細胞外基質主要成分是血管,血管形成是腫瘤轉移的重要因素,MMP-2,MMP-9均屬明膠酶類,是能夠降解IV型膠原的主要基質水解酶,其中MMP-9是MMPs系統中最大的酶、MMP-2能降解I型膠原纖維,均與細胞遷移密切相關,并在惡性腫瘤中都有過度的表達[22-25]。結果顯示,藻藍蛋白處理后,細胞中MMP-2、MMP-9蛋白水平的表達均有所下調(圖10)。結果與體外劃痕修復實驗一致。

3 結論

本論文以非小細胞肺癌H1299細胞模型為基礎,系統研究了藻藍蛋白對H1299細胞增殖、凋亡和遷移的影響。研究表明藻藍蛋白能夠通過影響細胞周期基因cyclinA,cdk2和p21的表達使細胞阻滯在S期,進而降低細胞活力,抑制細胞的生長和克隆形成能力;同時,藻藍蛋白能夠通過調控凋亡相關基因和蛋白的表達誘導H1299細胞發生凋亡;此外,藻藍蛋白也能通過降低MMP-2和MMP-9蛋白的表達水平而抑制H1299細胞的體外遷移能力。本研究充分證實了藻藍蛋白對非小細胞H1299細胞的抑制作用,為開發新型的具有抗肺癌功能的功能食品以及肺癌的治療提供了重要的理論依據和實驗基礎。