葛根水提液及葛根發酵液的體外抗氧化及抗衰老功效評價

吳 迪,劉平平,李 萌,*,王昌濤,2,趙 丹,張佳嬋

(1.北京工商大學理學院，北京市植物資源研究開發重點實驗室,北京 100048; 2.北京工商大學，北京食品營養與人類健康高精尖創新中心,北京 100048)

葛根(PuerariaDC.)又名葛藤、葛麻葉、甜葛藤、粉葛藤等[1]。葛根含有的活性成分為總黃酮,另外還含有少量的生物堿等。其中,葛根總黃酮中含有的異黃酮成分,是葛根的主要活性成分[2-4]。研究表明,葛根異黃酮是一種天然的抗氧化劑,具有較強的抗氧化作用[5]。此外,葛根素具有較強的抗缺氧和抗氧化作用[6]。西方的一些發達國家多在葛根素的提取及藥效方面進行研究,著重研究葛根黃酮的體內體外抗氧化活性和雌激素效應[7]。葛根的藥理作用主要有:對肝臟的保護作用、對基因表達的影響、抗氧化作用、輻射防護作用[8]。

在葛根的研究中,對其進行微生物發酵并對其進行抗衰老功效評價較少,故本實驗主要利用微生物發酵法對葛根中的有效成分進行提取,并與葛根水提液一同進行抗氧化及抗衰老功效測定,從而評價葛根水提液及葛根發酵液是否有潛在的抗衰老功效,為其在食品藥品中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粉葛片 云南白藥集團股份有限公司中藥飲片分公司;人皮膚成纖維細胞 中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心;黃酒酵母 北京市食品釀造研究所;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH)、胰酶(0.25% EDTA) 美國Sigma Aldrich公司;DMEM培養基、新生牛血清、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)、青霉素(1×105U/L)、鏈霉素(100 mg/L) 美國Gibco公司;人Ⅰ型膠原(COLI)酶聯免疫檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶檢測試劑盒、過氧化氫酶檢測試劑盒 碧云天生物技術有限公司;人基質金屬蛋白酶(MMP-1)酶聯免疫試劑盒 美國CUSABIO公司;MTT 北京拜爾迪生物技術有限公司;其余無機試劑 均為國產分析純。

BS2202S型電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司;DSHZ-300恒溫水浴振蕩器 江蘇省太倉市實驗設備廠;CO2恒溫培養箱 美國Thermo公司;高速臺式冷凍離心機 德國Sigma公司;Multiskan酶標儀 賽默費世爾(上海)儀器有限公司;UV-1240 紫外分光光度計 日本島津公司;YJ-2450醫用超凈工作臺 蘇州凈化設備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 葛根水提液及葛根發酵液的制備 葛根水提液的制備:選用50目葛根粉20 g,按照料液比為1∶15 (g/mL,下同)加入去離子水300 mL,70 ℃水浴搖床中提取3 h,冷卻后4900 r/min離心10 min,取上清液待測,過膜備用;葛根發酵液的制備:選用50目葛根粉20 g,按照料液比為1∶15,加入去離子水,高溫高壓滅菌后,接入5%的黃酒酵母擴培菌液,置于培養箱中28 ℃,180 r/min培養48 h,再次滅菌冷卻后4000 r/min離心10 min,取上清液,過膜備用。

1.2.2 主要活性成分的測定 吸取1 mL的葛根水提液及發酵液,分別測定其黃酮含量及總糖含量。

1.2.2.1 黃酮含量測定 按照硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法[25]測定。稱取5 mg干燥恒重的蘆丁標準品,用少量60%的乙醇攪拌溶解,后轉移到50 mL容量瓶中并定容,搖勻,得到濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標準液。分別吸取蘆丁標準液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分別置于六支10 mL比色管中,各加入30%乙醇溶液使比色管內均達到5 mL。后各取出1 mL于試管中,精確加入5% NaNO2溶液0.3 mL,搖勻放置6 min后,加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL,搖勻放置6 min。隨后加入4 mL濃度為1 mol/L的NaOH溶液,加水0.4 mL,搖勻放置15 min,以第1管為空白于510 nm波長下測定吸光度,以吸光度對標準品含量作圖,繪制標準曲線。樣品測定時,取葛根水提液、葛根發酵液2 mL,加入30%乙醇溶液使比色管內達到5 mL,取1 mL樣品加入0.3 mL 5% NaNO2溶液,搖勻放置6 min后,加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL,搖勻放置6 min。加入4 mL濃度為1 mol/L的NaOH溶液,加水0.4 mL,搖勻放置15 min,在510 nm下測定吸光度,用溶劑作為空白。所得黃酮標準曲線為y=0.3715x+0.0039(R2=0.99976)。

黃酮得率(%)=發酵液中黃酮含量×水提液(發酵液)體積×100/葛根粉質量

式(1)

1.2.2.2 總糖含量測定 按照苯酚-硫酸法[26]測定。準確稱取無水葡萄糖100 mg于100 mL容量瓶中,用蒸餾水定容,得到1 mg/mL葡萄糖溶液。苯酚10 g加水190 mL得5%苯酚溶液于棕色瓶中。量取1 mg/mL葡萄糖溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于50 mL容量瓶中定容,準確吸取該系列溶液各2 mL,分別置于試管中,進行比色反應。取稀釋200倍的葛根水提液、葛根發酵液2 mL于試管中,以2.0 mL去離子水做空白對照,加1 mL 5%苯酚溶液混勻。加入5.0 mL濃硫酸,混勻5 min后,沸水浴1 h。取出冷卻后至室溫,在490 nm處測吸光度。所得總糖的標準曲線為y=12.277x+0.0143(R2=0.998)。

總糖得率(%)=發酵液中總糖含量×水提液(發酵液)體積×100/葛根粉質量

式(2)

1.2.3 對DPPH自由基清除作用的測定 參考文獻[27-28]中的方法。將提取液與發酵液用去離子水稀釋五個梯度作為待測液,取等體積的待測液與2×10-4mol/L的DPPH溶液混勻為A1管;取等體積的無水乙醇與2×10-4mol/L的DPPH溶液混勻為A2管;取等體積的無水乙醇與待測液混勻為A3管。反應30 min后,在517 nm下利用測A1、A2、A3管吸光度。DPPH自由基清除率計算公式[29-33]如下。

清除率(%)=[(A2+A3)-A1]×100/A2

式(3)

1.2.4 細胞培養 將人皮膚成纖維細胞培養于含10%新生牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素的DMEM培養基,置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中,以0.05 g/100 mL胰酶消化傳代。將處于對數生長期的細胞接種于細胞培養板上進行培養,37 ℃5% CO2培養12 h。

1.2.5 細胞活力的測定 參考文獻[34]的方法,取對數生長期人皮膚成纖維細胞以0.05%胰酶消化、細胞培養液制備成單細胞懸液,細胞濃度為1×105/mL,接種于96孔細胞培養板中,每孔100 μL,過夜后,每孔加入100 μL含不同質量濃度樣品溶液或無樣品DMEM培養基,實驗設置調零組(DMEM)、細胞對照組(細胞+DMEM)、樣品組(細胞+不同濃度樣品溶液)。樣品組葛根水提液、葛根發酵液的樣品溶液終質量濃度均設定為0.06、0.18、0.53、1.67、5 mg/mL,每組5個平行孔。37 ℃、5% CO2條件下培養24、48、72 h。常規方法加入5 mg/mL噻唑藍(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)溶液與DMEM培養液混合溶液(體積比1∶5)100 μL處理4 h,150 μL二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)溶解,37 ℃孵育10 min,測定490 nm波長處吸光度。細胞活力按下式計算。

式(4)

1.2.6 人皮膚成纖維過氧化氫酶活力的測定 按照過氧化氫酶檢測試劑盒說明書進行樣品測定。標準曲線的繪制:取0.0、12.5、25.0、50.0、75.0 μL新鮮配制的5 mmol/L H2O2溶液,分別加入過氧化氫酶檢測緩沖液至最終體積為100 μL。分別取4 μL,加入96孔板的孔內。加入200 μL顯色工作液。25 ℃孵育15 min,測定520 nm波長處吸光度A,得到標準曲線為y=39.631x-0.0003,R2=0.99845。分別取3 μL經葛根水提液、葛根發酵液樣品處理24 h的細胞裂解液(蛋白濃度已測定),添加過氧化氫酶檢測緩沖液至體積為40 μL,混勻。再加入10 μL 250 mmol/L H2O2溶液,用移液器迅速混勻。反應 3 min后,加入450 μL過氧化氫酶反應終止液,對照標準曲線計算殘余H2O2濃度。換一潔凈離心管,加入40 μL過氧化氫酶檢測緩沖液,再加入10 μL已終止并混勻的上述反應體系,混勻。25 ℃孵育15 min后,測定520 nm波長處吸光度A,計算過氧化氫酶活力。

消耗過氧化氫(μmol/L)=空白對照殘余過氧化氫-樣品殘余過氧化氫

過氧化氫酶活力(U/mg蛋白)=[消耗過氧化氫×稀釋倍數]/[(反應時間)×(樣品體積)×(蛋白濃度)]

1.2.7 人皮膚成纖維谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活力的測定 按照谷胱甘肽過氧化物酶檢測試劑盒說明書進行樣品測定。依次配制10 mmol/L NADPH溶液、84 mmol/L GSH溶液、GPx檢測工作液、過氧化物試劑溶液,均溫育到25 ℃。設定空白對照組(GPx檢測緩沖液186 μL+GPx檢測工作液10 μL+過氧化物試劑溶液4 μL)、樣品本底對照組(Gpx檢測緩沖液180 μL+GPx檢測工作液10 μL+待測樣品10 μL)、樣品組(GPx檢測緩沖液176 μL+GPx檢測工作液10 μL+待測樣品10 μL+過氧化物試劑溶液4 μL)。依次加入檢測緩沖液、待測樣品和檢測工作液,混勻,加入過氧化物試劑溶液4 μL,反應開始。保持測定溫度為25 ℃,每隔30 s,使用酶標儀測定A340,共測6次。根據谷胱甘肽過氧化物酶酶活力單位的定義測定GPx活力。

檢測體系中谷胱甘肽過氧化物酶活力=(A340/樣品反應時間-A340/空白反應時間)/0.00622

谷胱甘肽過氧化物酶活力(mU/mg蛋白)=檢測體系重谷胱甘肽過氧化物酶活力×稀釋倍數/樣品中蛋白濃度(U/mg)

1.2.8 人皮膚成纖維細胞I型膠原(Collagen I)含量的測定 按照人I型膠原酶聯免疫檢測試劑盒說明書進行樣品測定。葛根水提液、葛根發酵液樣品溶液在3個質量濃度(0.06、0.53、5.00 mg/mL)條件下處理人皮膚成纖維細胞24 h后,取細胞培養液上清液,于2～8 ℃、1000×g離心15 min,取上清液立即進行測定。在預先包被了抗體的酶標孔中加入樣品或標準品,在加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的識別抗原,在37 ℃條件下孵育1 h,兩者與固相抗原競爭結合形成免疫復合物,經PBST洗滌后,結合的HRP催化四甲基聯苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)成藍色,隨后在酸的作用下轉化成黃色,在450 nm波長處測定吸光度。同時,測定出膠原標準品的OD值,并以OD值為縱坐標,膠原濃度為橫坐標,用Curve Expert1.4擬合出膠原含量的標準曲線 y=a/(1+be-cx)(a=-2.546,b=-2.518,c=-3.478),并由所測細胞培養上清液的OD值計算出樣品中所含膠原含量。

1.2.9 人皮膚成纖維細胞MMP-1含量的測定 按照MMP-1酶聯免疫檢測試劑盒說明書進行樣品測定。葛根水提液、葛根發酵液在5個質量濃度條件下(0.06、0.18、0.53、1.67、5 mg/mL)處理人皮膚成纖維細胞24 h后,取細胞培養液上清液,于2～8 ℃、1000×g離心15 min,取上清液立即進行測定。在包被有純化MMP-1抗體的微孔板中,依次加入樣品或標準品、生物素化的抗MMP-1抗體、HRP標記的親和素,經徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的作用下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成黃色。顏色的深淺與樣品中MMP-1含量呈正相關。用酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度,對照標準曲線來計算樣品刺激后MMP-1含量,標準曲線為y=a/(1+be-cx)(a=1.111,b=2.436,c=1.134)。

1.3 數據處理

本實驗均設置3組平行,實驗數據利用SPSS 19.0軟件進行統計學處理,兩兩比較采用t檢驗,以p<0.05為差異有統計學意義,所得結果以x±s表示。

2 結果與分析

2.1 葛根水提液(PWE)、葛根發酵液(PFB)中活性成分測定結果

表1為葛根水提液及葛根發酵液中黃酮、總糖含量測定結果。表1顯示,葛根水提物、葛根發酵液中均含有豐富的黃酮、糖類。其中,葛根水提液中,黃酮得率為5.25%,含量為(3.47±0.23) mg/mL,總糖的得率為5.19%,含量為(3.46±0.18) mg/mL。葛根發酵液中,黃酮得率為7.20%,含量為(4.80±0.32) mg/mL,總糖的得率為3.78%,含量為(2.52±0.50) mg/mL。說明與葛根水提液相比,葛根發酵液中的黃酮含量較高,其總糖含量相對較低。

表1 葛根水提液及葛根發酵液中黃酮、總糖含量Table 1 Content of flavonoids,total sugar in PWE,PFB

2.2 PWE、PFB對DPPH自由基的清除作用

葛根的水提液和葛根發酵液對DPPH自由基的清除作用見圖1。從圖1可知,在質量濃度為2.67～4.44 mg/mL,相同質量濃度下葛根發酵液對DPPH自由基的清除率高于葛根水提液。在質量濃度在4.44～13.3 mg/mL間,兩者差異并不顯著。通過數據計算得出,葛根水提液清除DPPH自由基的IC50為3.51 mg/mL。葛根發酵液清除DPPH自由基的IC50為2.98 mg/mL。說明葛根發酵液在較低濃度即可清除50%的DPPH自由基,葛根水提液所需濃度較高。

圖1 葛根水提液、葛根發酵液清除DPPH自由基的能力Fig.1 DPPH radical scavenging capacity of PWE and PFB

2.3 PWE、PFB對人皮膚成纖維細胞活力的影響

通過MTT實驗探究不同濃度的葛根提取液對成纖維細胞的細胞活力的影響,結果見圖2～圖3。由圖可知,葛根水提液及葛根發酵液均未表現出強烈的細胞毒性,細胞活力均在85%以上。相同質量濃度下,樣品的作用時間對細胞活力無顯著影響,因此本實驗選用樣品作用時間為24 h進行后續實驗。本實驗選擇了三個濃度,分別為5 mg/mL(高劑量組)、0.53 mg/mL(中劑量組)、0.06 mg/mL(低劑量組)進行后續實驗。

圖2 不同質量濃度的葛根水提液對細胞活力的影響Fig.2 Effect of different concentrations of PWE on cell viability of human skin fibroblasts

圖3 不同質量濃度的葛根發酵液對細胞活力的影響Fig.3 Effect of different concentrations of PFB on cell viability of human skin fibroblasts

2.4 PWB、PFB對人皮膚成纖維細胞過氧化氫酶的影響

圖4為葛根水提液、葛根發酵液對細胞中過氧化氫酶活力的影響。由圖4可知,在質量濃度為0.53、5 mg/mL時,經葛根水提液及葛根發酵液處理后的細胞可以極顯著增強細胞內過氧化氫酶的酶活力(p<0.01)。質量濃度為0.06 mg/mL時,作用不顯著(p>0.05)。相同質量濃度的兩種樣品對細胞中過氧化氫酶活力影響不顯著(p>0.05)。由此說明葛根水提液及發酵液能夠增強細胞內過氧化氫酶酶活力,氧化氫酶是機體內反應細胞氧化水平的重要標志性酶之一,其主要作用是催化體內的過氧化氫分解成氧氣和水,從而避免過量的H2O2與O2在鐵螯合物的作用下生成對細胞有害的羥基[35]。宋菲等人[36]經過研究證實,天然椰子油提取物可通過提高細胞內抗氧化酶的活性,進而對 H2O2引起的細胞氧化應激損傷起到一定的保護作用。衰老自由基學說認為,機體自由基累積引發的氧化應激損傷在皮膚衰老中發揮重要作用,氧化應激指機體內活性氧產生和清除失衡、抗氧化能力降低,自由基產生增多一種狀態,過度的氧化應激產生的過氧化物會破壞DNA和蛋白質結構,導致生物膜和細胞核的損傷,引發細胞凋亡,是衰老的主要成因之一[37]。由此說明,葛根水提液及發酵液能夠通過增強細胞內過氧化氫酶活力,從而加快細胞內過氧化物的分解,達到抗衰老的功效。

圖4 葛根水提液、葛根發酵液對細胞中過氧化氫酶活力的影響Fig.4 Effect on PWE and PFB on catalase activity注:*代表樣品組與細胞對照組差異顯著(p<0.05);**代表樣品組與細胞對照組差異極顯著(p<0.01);圖5～圖6同。

2.5 PWE、PFB對人皮膚成纖維細胞谷胱甘肽過氧化物酶活力影響

由圖5可知,在質量濃度為0.06、0.53 mg/mL時,葛根水提液可以極顯著增強細胞內谷胱甘肽過氧化物酶的酶活力(p<0.01),葛根發酵液處理后的細胞可以顯著增強細胞內谷胱甘肽過氧化物酶的酶活力(p<0.05),質量濃度為5.00 mg/mL時,作用不顯著(p>0.05)。不同樣品下相同質量濃度的樣品對細胞中細胞谷胱甘肽過氧化物酶酶活力的影響差異不顯著(p>0.05),葛根水提液及發酵液均在質量濃度為0.53 mg/mL時,增加谷胱甘肽過氧化物酶酶活力作用更為顯著。由此說明,葛根水提液及發酵液能夠增強細胞內谷胱甘肽過氧化物酶的酶活力,谷胱甘肽過氧化物酶[38]是機體內廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解的酶,特異的催化還原型谷胱甘肽對過氧化氫的還原反應可以起到保護細胞膜結構和功能完整的作用。馮冰等人[39]實驗證明,過氧化氫誘導人皮膚成纖維細胞氧化損傷后,EGCG能夠有效降低細胞內谷胱甘肽過氧化物酶降低,同時EGCG可將其作為植物提取物防護細胞損傷研究的陽性對照。由此說明,葛根水提液、葛根發酵液能夠通過增加細胞內谷胱甘肽過氧化物酶的酶活力,從而增強細胞內清除過氧化物的能力,達到抗衰老的效果。

圖5 葛根水提液、葛根發酵液對細胞中谷胱甘肽過氧化物酶活力的影響Fig.5 Effect on PWE and PFB on GSH-Px activity

2.6 PWE、PFB對細胞中MMP-1含量、Ⅰ型膠原含量的影響

由圖6A可知,葛根水提液質量濃度為0.06、5 mg/mL，可以顯著降低人皮膚成纖維細胞中MMP-1含量(p<0.05),葛根發酵液作用下的MMP-1減少率較葛根水提液更高,作用極為顯著(p<0.01)，葛根水提液質量濃度為0.53 mg/mL時,作用不顯著。由圖6B可知,在質量濃度為0.06、5 mg/mL時,葛根水提液可以顯著增加人皮膚成纖維細胞中Ⅰ型膠原的含量(p<0.05),當質量濃度為0.53 mg/mL時,作用不顯著(p>0.05)。另外，葛根發酵液作用下的細胞Ⅰ型膠原的增加率較葛根水提液更高,作用極為顯著(p<0.01)。濃度為0.06 mg/mL的葛根發酵液與葛根水提液增加量最多,分別為(26.67±2.10) ng/mL、(21.47±1.66) ng/mL,分別是細胞對照組的2.5倍、2倍(細胞對照組為(10.79±0.98) ng/mL)。生化實驗中,葛根發酵液相比于葛根水提液,清除DPPH自由基的作用更為顯著。而在細胞實驗中,葛根發酵液比葛根水提液均能夠增加細胞內膠原蛋白的含量。此差異很有可能是因體外抗氧化實驗機理與細胞實驗中細胞內過氧化物及相關物質的產生機理不同,所以結果上有差異。

圖6 葛根水提液、葛根發酵液對人皮膚成纖維細胞MMP-1(A)和I型膠原蛋白含量(B)的影響Fig.6 Effect of PWE,PFB on MMP-1(A) and COL I(B)contents

3 結論

本研究的結果表明,葛根發酵液中的黃酮含量高于葛根水提液,葛根水提液的總糖在一定程度上高于葛根發酵液。葛根發酵液能有效清除DPPH自由基,且清除率基本保持在50%及以上,作用較為明顯,可初步表明葛根發酵液具有一定的抗氧化活性。體外細胞實驗結果表明,不同濃度的葛根水提液及葛根發酵液能夠不同程度上保持較高的細胞活力,均為表現出強烈的細胞毒性,細胞活力均在85%以上;此外,與對照組相比,葛根水提液及葛根發酵液處理后的細胞可以極顯著增強細胞內過氧化氫酶酶活力(p<0.01)、谷胱甘肽酶酶活力(p<0.01),不同樣品下相同質量濃度的樣品差異明顯,由此說明葛根水提液及發酵液均能夠在一定程度上減少過氧化物對細胞的損傷,達到抗衰老的效果。與對照組相比,在質量濃度為0.06、5 mg/mL時,葛根水提液及葛根發酵液處理后的細胞可以顯著減少MMP-1的含量(p<0.05),增加細胞中Ⅰ型膠原的含量(p<0.05),不同樣品下相同質量濃度的樣品差異明顯。葛根發酵液相較于葛根水提液,抗氧化及抗衰老作用更為明顯。綜上所述,葛根水提液及葛根發酵液均具有不同程度的抗氧化功效和抗衰老功效。