管式氣氛爐聯用HPLCICPMS測定黑木耳中的三價鉻和六價鉻

李冰茹,劉 靜,王北洪,李 楊,何昭穎,馬智宏

(北京農業質量標準與檢測技術研究中心,農業部農產品質量安全風險評估實驗室,北京 100097)

鉻(Cr)主要以Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的形式在植物或動物體內存在,形態決定其是必需元素還是有害元素,其三價態作為葡萄糖耐受因子成分參與體內糖、脂類、蛋白質和核酸的代謝,但較高劑量的Cr(Ⅲ)仍表現出細胞毒性反應[1-2];六價態會破壞DNA,具有強致癌效應[3]。因此,痕量鉻的含量和化學形態對人類的健康有著重要的影響[3-4]。

樣品前處理是檢測鉻形態的技術前提,直接影響檢測結果的精度和準度。科學合理的前處理方法可以有效提高消解效率[5-6]。超聲萃取[4]、微波萃取[5]等方法被用于測定膠囊、營養品、面粉中、保健食品[7-9]的Cr(Ⅲ)或Cr(Ⅵ),有著較好的穩定性和檢出率。王曉波等[10]以及任鳳蓮等[11]采用濁點萃取方法、8-羥基喹啉(8-HQ)為鰲合劑分離出Cr(Ⅲ),通過計算總鉻和Cr(Ⅲ)的含量間接推算出Cr(Ⅵ)含量,但是該方法在酸提取時需要浸泡6 h,用時較長。章劍揚等[12]利用EDTA二鈉鹽和硝酸銨溶液為提取液,采用加速溶劑萃取技術(ASE)對茶葉中2種價態鉻進行提取,具有自動化程度高和同時測定2種價態的優點。席永清等[13]研究了在光盤上制備固相萃取柱的方法,設計了由5層結構組成的離心式微流控光盤,應用于Cr(Ⅲ)與Cr(Ⅵ)的分離,ICP-MS法檢測總鉻與未被固相萃取柱吸附的Cr(Ⅵ)含量,從而計算溶液中Cr(Ⅲ)含量。張毅等[14]以自制的PTFE微柱,對需要測定的Cr(Ⅲ)離子進行富集,取得理想檢測效果。上述前處理方法有的耗時較長,有的裝置復雜。因此溫和簡便的前處理分離測定以及避免使用還原性試劑是鉻形態分析方法研究的關鍵。為此,本文建立以管式爐通入高純氦氣的前處理方法與高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜聯用[15-19]測定鉻元素形態的新方法。通入高純氦氣是因為使用傳統的馬弗爐是在有氧情況下進行炭化,高溫下氧的存在增加了Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的轉化[20],而管式氣氛爐在無氧條件下高純氦氣作為保護氣,高溫下消解樣品中的有機物,能夠保持樣品中Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)不發生轉化,因此本實驗采用高溫管式爐無氧條件下高純氦氣保護對黑木耳樣品進行處理。

近年的文獻[21-22]及農業部風險評估專項監測發現:黑木耳中鉻含量較高[23],但是黑木耳中鉻形態含量的研究卻少見報道,因此對其中的Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)測定有一定的營養安全意義。本實驗以干制的黑木耳為例,在高溫下高純氦氣保護下進行炭化,且保證炭化中鉻的價態不發生轉變,然后用流動相的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)溶液絡合,形成穩定的Cr(Ⅲ)-EDTA,通過高效液相色譜柱分離,利用ICP-MS檢測Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

木耳 北京各大超市及批發市場,袋裝或散裝;硝酸 優級純,德國默克公司;Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)標準溶液 1000 mg/L,北京市環境保護所;EDTA-2Na 分析純,北京化工有限公司;氨水 優級純,北京市通廣精細化工公司;質譜調諧液 美國Perkin Elmer公司。

NexIon 350 ICP-MS 美國PerkinElmer公司;GSL-1100X管式氣氛爐 合肥科晶材料有限公司;Flexar液相泵 美國PerkinElmer公司;超聲清洗機 江蘇昆山超聲儀器公司;粉碎機 德國IKA集團;超純水 中揚超純水系統;石英坩堝 無錫市鑫石陶瓷有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 黑木耳樣品粉碎后過40目篩,過篩稱取0.2000 g放入管式氣氛爐中進行炭化,在10 min內勻速升溫到450 ℃并保持2 h,然后冷卻至室溫,用pH7.0的流動相且含0.5 mmol/L EDTA-2Na溶液定容至50 mL;將定容好的樣品超聲15 min,溫度37 ℃,超聲功率700 W,在放置60 ℃的水浴中靜置60 min,使EDTA-2Na與Cr(Ⅲ)充分絡合,取出冷卻室溫,過0.45 μm微孔濾膜,待上機測定。同時做空白試驗和加標回收。

1.2.2 前處理條件單因素實驗

1.2.2.1 樣品炭化溫度 黑木耳樣品粉碎后過40目篩,過篩稱取0.2000 g放入管式爐中,在10 min內勻速升溫,分別升溫至200、300、350、400、450、500、600、650、700 ℃等并保持2 h,然后冷卻至室溫,其他步驟參照1.2.1,根據測定的鉻含量選擇最佳炭化溫度。

1.2.2.2 樣品炭化時間 黑木耳樣品粉碎后過40目篩,過篩稱取0.2000 g放入管式爐中,在10 min內勻速升溫至450 ℃,分別保持1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h炭化時間,然后冷卻至室溫,根據測定的鉻含量選擇最佳炭化時間。

1.2.2.3 超聲反應時間 按照1.2.1方法,將定容好的樣品在0、5、10、15、20、30 min時間下進行超聲實驗,超聲條件為溫度37 ℃,功率700 W,根據測定的鉻含量確定最佳超聲時間。

1.2.2.4 絡合溫度和絡合時間 按照1.2.1方法,將定容好的樣品在15 min,溫度37 ℃,功率700 W條件下進行超聲實驗后,分別在30、40、50、60、70、80 ℃溫度下分別靜置20、30、60、90、120 min進行交叉實驗,根據測定的Cr(Ⅲ)含量選擇EDTA-2Na與Cr(Ⅲ)的最佳絡合反應時間與溫度。EDTA-2Na與Cr(Ⅲ)充分絡合,取出冷卻室溫,過0.45 μm微孔濾膜,待測。

1.2.3 標準曲線的繪制 將Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)標準溶液用pH=7的流動相且含0.5 mmol/L EDTA-2Na的溶液稀釋至0.1 mg/L,作為標準儲備液,然后再用流動相配成濃度為0、0.4、1.0、2.0、4.0、10.0、20.0 μg/L的Cr(Ⅲ)、Cr(Ⅵ)標準溶液系列,采用外標法,保留時間定性,峰面積定量。

1.2.4 加標回收實驗 對干木耳做加標回收試驗,其中Cr(VI)的添加水平分別為0.5、2.5和10.0 mg/kg,Cr(Ⅲ)的添加水平分別為5.0、10.0和20.0 mg/kg,按1.2.1步驟進行測定。

1.3 儀器條件

色譜條件為:Hamilton PRP-X100陰離子交換柱(250 mm×4.6 mm,10 μm),流動相為60 mmol/L硝酸銨(pH=7.0,稀氨水調節),流速為1.0 mL/min,進樣量為50 μL,柱溫25 ℃。

CP-MS工作參數為:RF功率1550 W,載氣流量1.14 mL/min,采用碰撞反應模式,反應氣體為He,氦氣流量為2.0 mL/min、Rpq值為0.25,測量同位素:52Cr,主要技術參數參見表1。

表1 ICP-MS的碰撞模式下主要技術參數Table 1 The parameters of ICP-MS with KED mode

1.4 數據處理

本實驗利用Excel(10.1.0.7566)進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 樣品處理條件分析

2.1.1 炭化溫度及時間 黑木耳在不同溫度下的炭化效果如圖1所示,400 ℃以下樣品不能較好炭化,尤其是部分大分子有機物質未能徹底炭化,導致一些結合態的鉻不能完全釋放出來,提取效率偏低;當溫度高于600 ℃以后,鉻與炭高溫下反生反應,生成難熔的炭化鉻化合物,造成提取樣本含量偏低。因此,綜合考慮炭化溫度選擇450 ℃,效果最佳。

圖1 炭化溫度對提取樣本含量影響Fig.1 Effect of different carbonization temperatures on the content of extrated samples

黑木耳在不同時間的炭化效果如圖2所示,當炭化時間低于2.0 h時,樣品中的有機物還沒有徹底炭化,結合態的鉻還沒有完全釋放出來,會造成提取出的樣本含量結果偏低;隨著時間增長,鉻可能因揮發也會導致提取樣本含量偏低,因此選擇炭化的時間為2.0 h。

圖2 炭化時間對提取樣本含量的影響Fig.2 Effect of different carbonization time on the content of extrated samples

2.1.2 超聲反應時間 超聲反應時間對于鉻含量的檢測有著明顯影響,按照1.2.2步驟檢測后的結果如圖3所示。由圖3可見,隨著超聲時間的逐步增加,0～15 min內鉻的含量明顯升高,這是因為超聲能夠防止炭對Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)吸附。15 min之后趨于穩定,故選擇超聲時間為15 min。

圖3 超聲時間對絡合反應的影響Fig.3 Effects of the ultrasonic time on the complexation reaction

2.1.3 Cr(Ⅲ)-EDTA絡合溫度和時間 如圖4所示,在50 ℃時絡合達到相對最優效果,因此50 ℃作為Cr(Ⅲ)-EDTA的絡合溫度。圖5分析絡合時間對于Cr(Ⅵ)的含量和Cr(Ⅲ)的含量的影響,發現隨著時間增加Cr(Ⅵ)的含量無明顯變化,Cr(Ⅲ)的含量呈現較大變化,由20至60 min時明顯上升,后又趨于平穩,如圖5所示。因此選擇60 min作為Cr(Ⅲ)-EDTA絡合時間。

圖4 絡合溫度對Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)含量的影響Fig.4 Effects of the complexation temperature on the concentration of Cr(Ⅲ)and Cr(Ⅵ)

圖5 Cr(Ⅲ)-EDTA絡合反應時間對鉻含量的影響Fig.5 Effects of Cr(Ⅲ)-EDTA complexation time on the concentration of Cr

2.2 檢測條件優化

2.2.1 流動相的選擇 本實驗采用陰離子色譜柱分離Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)。鉻的兩種價態Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)在不同的pH環境下穩定性有很大差異。當68時,Cr(Ⅲ)易水解生成沉淀;而在酸性條件pH<6時,Cr(Ⅵ)易轉化為Cr(Ⅲ)[25]。因此為了提高樣品在HPLC-ICP-MS分析過程的穩定性,采用pH=7.0的60 mmol/L硝酸銨溶液為流動相。

2.2.2 質譜干擾的消除 KED模式能夠很好的消除其他雜質干擾,從圖6在KED模式下檢測52Cr得到的Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的色譜圖可以看出,色譜圖中只有Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的峰,其峰識別線(圖中帶三角標識的短線)清晰地標識了元素類別。

圖6 KED模式下的Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)色譜圖Fig.6 Chromatogram of Cr(Ⅲ)and Cr(Ⅵ)under KED model

2.2.3 線性關系 Cr(Ⅲ)的線性方程為y=1530.7x-120.16,R2=0.9998;Cr(Ⅵ)的線性方程為y=18582x-804,R2=0.9999。在0.1～50 μg/L范圍內,線性關系良好,R2均達到0.9998以上,檢出限分別為Cr(Ⅲ)0.2 μg/L、Cr(Ⅵ)0.1 μg/L。

2.2.4 空白試驗 為了驗證鉻的形態在炭化過程中未發生Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的轉化,將Cr(Ⅲ)或Cr(Ⅵ)標樣按照實驗方法進行炭化、定容、檢測,譜圖如圖7所示。圖7中A是空白譜圖,既沒有Cr(III)的衍生峰,也沒有Cr(Ⅵ)的衍生峰。圖7中B是添加Cr(Ⅲ)標樣的譜圖,圖中有兩個峰識別線(帶三角標識的短線),其中Cr(Ⅲ)具有非常明顯的衍生峰,而Cr(Ⅵ)則沒有峰。這說明利用管式氣氛爐通入惰性氣體進行保護炭化,能夠防止傳統馬弗爐有氧情況下進行炭化,導致Cr(Ⅲ)向Cr(Ⅵ)轉化現象的發生。

圖7 空白色譜圖和加標Cr(Ⅲ)色譜圖Fig.7 Blank chromatogram and recovery of Cr(Ⅲ)chromatogram

2.2.5 回收率與精密度 加標實驗結果如表2所示:Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的回收率范圍分別為80.0%～91.0%和80.2%～92.3%,RSD分別為2.0%～3.4%和1.5%～3.7%,證明本實驗方法可用于干黑木耳中Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的檢測。

表2 Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)加標回收率Table 2 Recovery rate of Cr(Ⅲ)and Cr(Ⅵ)

2.3 實際樣品測定

隨機從市場上選擇10份干黑木耳樣品進行測試,結果見表3。樣品中Cr(Ⅲ)含量在0.12～4.30 mg/kg之間,均未檢出Cr(Ⅵ)。我國的食品標準GB2762-2017食品安全國家標準食品中污染物限量中蔬菜總鉻限量值0.5 mg/kg,90%以上的樣品超標。色譜如圖8所示,其中一個樣本的色譜圖中Cr(Ⅵ)有峰標識線而無明顯的衍生峰。

表3 干黑木耳樣品中Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的實際檢測值Table 3 Contents of Cr(Ⅲ)and Cr(Ⅵ)in Auricularia auricula samples

圖8 實測樣品色譜圖Fig.8 Chromatogram of measured sample

3 結論

本文建立了管式氣氛爐無氧炭化-高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜(HPLC-ICP-MS)檢測干黑木耳中Cr(III)和Cr(VI)的方法。對樣品在惰性氣體保護下450 ℃進行2 h炭化處理后,加50 mL絡合液超聲處理,其優化條件為超聲提取時間15 min,絡合溫度為60 ℃,絡合時間為60 min。在惰性氣體的保護下,樣本在炭化過程中不發生氧化還原反應,保證樣本中被檢測元素的價態不發生轉化。Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的平均回收率范圍分別為80.0%～91.0%和80.2%～92.3%,RSD分別為2.0%～3.4%和1.5%～3.7%。該方法操作簡單,炭化過程無需添加酸堿試劑,不改變鉻的價態,穩定好且回收率高,可推廣用于農產品及其含多糖與膠質較高樣品的鉻不同價態的測定。