部分地區蕎麥食品中黃曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的污染評價

王 艷,胡 濤,朱麗偉,楊麗娟,黃小燕,陳慶富

(貴州師范大學蕎麥產業技術研究中心,貴州貴陽 550001)

國內外黃曲霉毒素的研究主要集中在花生、玉米等糧油產品、奶制品和飼料等領域[5-7],研究的主要內容包括黃曲霉毒素污染情況調查,致病機理、限量標準、檢測方法和技術改進、風險評估及防控措施等方面[8-10]。蕎麥屬于小宗糧食作物,相關研究較少,研究不同地區的蕎麥食品黃曲霉毒素污染情況對制定黃曲霉毒素AFT限定標準具有重要的意義。目前中國、美國和日本等國家都制定了食品黃曲霉毒素限量標準和法規。美國對一般食品里面黃曲霉毒素食品中黃曲霉毒素(AFB1+AFB2+AFG1+AFG2)的最大殘留限量為15 μg/kg,日本要求更為嚴格進口食品不得檢出黃曲霉毒素,中國目前只對黃曲霉毒素AFB1制定了限量標準,AFB1在蕎麥以及制品中最大限量為5 μg/kg,并沒有黃曲霉毒素AFT總量的限制要求。

蕎麥及其食品也存在黃曲霉毒素污染風險,針對蕎麥在黃曲霉毒素研究較少和黃曲霉毒素AFT限量標準沒有制定的情況,非常有必要展開蕎麥黃曲霉毒素污染的調查,本文對我國6個地區6個類型蕎麥食品4種黃曲霉毒素(AFB1、AFG1、AFB2、AFG2)進行調查分析其污染狀況,為了解蕎麥食品受黃曲霉毒素污染狀況提供基礎資料,為黃曲霉毒素總量(AFB1+AFG1+AFB2+AFG2)限量標準提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蕎麥食品 2016年11月份從超市、蕎麥技術產業研究中心和威寧的公司采集了63份蕎麥食品,涉及到6個地區6個加工類型的蕎麥食品選取,每份樣品的采樣量不少于500 g,散裝樣品每份采500 g,樣品的詳細信息見表1;黃曲霉毒素AFB1、AFG1、AFB2、AFG2標準品(純度≥98,CAS號分別是1162-65-8,7220-81-7,1165-39-5,7241-98-7) 北京百靈威公司;甲醇、乙腈 均為色譜純,德國Merck公司;正己烷 色譜純,美國Tedia公司;三氟乙酸 分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

表1 樣品信息Table 1 Sample information

續表

L-2000高效液相色譜儀(帶熒光檢測器) 日本日立公司;Afla StarTMR黃曲霉毒素免疫親和柱 Romer Labs公司; KS-5200DE液晶超聲清洗器 昆山潔力美超聲儀器有限公司;TG-16G高速冷凍離心機 常州萬豐儀器制造有限公司;WH-861渦旋混合器 太倉華利達實驗設備有限公司;Exceed-Ca純水超純水組合系統 成都艾柯唐氏康寧科技發展有限公司;DK-98-ⅡA電熱恒溫水浴鍋 天津泰斯特儀器有限公司;N-EVAPTM112氮吹儀 美國Organomation Associates公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品衍生預處理 稱取5 g粉碎的試樣(粒徑小于2 mm)于50 mL離心管中,加入20 mL乙腈-甲醇(50∶50,體積比)提取,置于超聲振蕩 20 min,在6000 r/min下離心10 min,移取約8 mL提取液經過功能凈化管凈化后,從收集池內準確移取2 mL凈化液于棕色具塞小瓶中,50 ℃水浴下氮氣吹干,加入200 μL正己烷和100 μL三氟乙酸,渦旋30 s混勻后,(40±1) ℃恒溫箱衍生15 min。氮氣吹干,以初始流動相乙腈-水溶液(50∶50,體積比)定容至 1.0 mL,渦旋 30 s溶解殘留物,過0.22 μm 濾膜,待測。

1.2.2 黃曲霉毒素的測定 參考GB 5009. 22-2016《食品安全國家標準食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》中提供的柱前衍生高效液相色譜法進行測定[11],待測樣品由農業部農產加工品質量監督檢驗測試中心(北京)檢測,并出具結果,檢測的項目包括黃曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2,四個檢測項目的檢出限均為0.03 μg/kg。

1.2.3 檢測色譜條件 色譜柱:Waters Symmetry C18(4.6 mm×150 mm,5.0 μm);柱溫:40 ℃;激發波長:360 nm；發射波長:440 nm;進樣體積:50 μL。

1.2.4 標準曲線繪制 通過高效液相色譜儀(帶熒光檢測器)進行測定,分別取1 mL黃曲霉毒素混合標準質量濃度分別為1.0、2.0、5.0、10、20 μg/g,按照1.2.1方法衍生,色譜條件同1.2.3,進行色譜測定,計算不同濃度下的峰面積。以峰面積(Y)對標準品的質量濃度(X)進行線線性回歸,結果見表2。

表2 黃曲霉毒素標準曲線回歸方程、相關系數Table 2 Regression equation and correlation coefficient of aflatoxin standard curve

1.3 統計處理

采用SPSS 17. 0 軟件進行方差統計分析,p<0.05為差異有統計學意義。檢測結果以大于方法的檢出限為陽性(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2檢出限均為0.03 μg/kg),超標判斷標準是以美國食品藥品監督管理局對黃曲霉毒素在食品中的殘留限量規定為依據。樣品中檢出4種黃曲霉中的任意一種,即判定該樣品AFs陽性,樣品中檢出毒素濃度之和即為該樣品AFs含量。

2 結果與分析

2.1 蕎麥食品黃曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2及AFs的調查結果

由表3可知,對63份樣品進行AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的含量檢測,結果顯示,有22份樣品檢出黃曲霉毒素,主要以AFB1和AFG1為主,AFB1、AFB2、AFG1、AFG2四種黃曲霉毒素的陽性率分別是:14.29%、9.52%、17.46%、1.59%。AFs陽性率為34.92%,AFs陽性樣品的平均濃度為5.48 μg/kg,AFs濃度范圍為0.16～26.80 μg/kg。本文和高秀芬等[12]對花生的黃曲霉毒素污染調查比較,從6個省份采集197份花生,陽性率58.38%,AFs陽性樣品的平均濃度為91.74 μg/kg,濃度范圍為0.20～2496.28 μg/kg,和花生比較蕎麥陽性率低于花生陽性率,平均濃度遠低于花生平均濃度,花生的濃度范圍更廣,遠超蕎麥的濃度范圍,不同的是高秀芬的調查中花生的黃曲霉毒素主要是AFB1。四種黃曲霉毒素陽性率AFB1>AFB2>AFG1>AFG2。蕎麥中主要是AFB1和AFG1,四種黃曲霉毒素陽性率AFG1>AFB1>AFB2>AFG2。根據美國食品藥品監督管理局對黃曲霉毒素在食品中的殘留限量規定為15 μg/kg[13],有兩份樣品超過15 μg/kg,超標率為3.17%,分別是邛都黑蕎麥面條(24.6 μg/kg)、御酥坊金裝蕎酥(26.8 μg/kg)。按照食品中真菌毒素限量規定,小麥、大麥以及蕎麥食品AFB1限量為5 μg/kg[14],和美國食品藥品監督管理局(FDA)規定AFB1標準是一致的,超標食品其中最高的是邛都黑蕎麥面條(13.2 μg/kg)，其次是伊田面館蕎麥面(6.01 μg/kg)、中裕蕎麥掛面(5.60 μg/kg),AFB1陽性率為14.29%,超標率為4.76%。

表3 黃曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2及AFs的調查結果Table 3 Investigation results of aflatoxin AFB1、AFB2、AFG1、AFG2and AFs

2.2 不同地區黃曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2及AFs污染情況

由表4可知,不同地區黃曲霉污染情況不一樣,從陽性率看,黃曲霉毒素AFs陽性率華北地區、西北地區陽性率最高為50.00%,AFB1陽性率華北地區最高為50.00%,AFB2陽性率華北和西北地區最高為16.67%,AFG1陽性率沿海地區最高為25.00%,AFG2陽性率西南地區最高為2.44%,其中華中地區沒有檢出黃曲霉毒素。從均值上看,AFs均值華北地區最高為3.10 μg/kg,AFB1均值華北地區最高為2.08 μg/kg,AFB2、AFG1、AFG2的均值最高為西南地區,均值分別為0.19、1.46、0.09 μg/kg,從超標情況看,不同地區的濃度范圍只有西南地區高于15 μg/kg,西南地區的濃度范圍為0.159～26.8 μg/kg,其他地區的濃度范圍都低于15 μg/kg,超標樣品均為西南地區,總體看除了華中地區,其他地區蕎麥食品都存在不同程度的黃曲霉毒素污染。

表4 不同地區黃曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2及AFs污染情況Table 4 Pollution of aflatoxin AFB1、AFB2、AFG1、AFG2 and AFs in different areas

2.3 不同類型的蕎麥食品黃曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2污染情況

由表5可知,不同類型蕎麥食品黃曲霉毒素污染情況不一樣,從陽性率看,黃曲霉毒素AFs、AFB1二者陽性率最高的都為蕎麥面,陽性率均為53.85%,AFB2陽性率蕎麥茶最高為45.45%,AFG1陽性率蕎麥種子最高為40%,AFG2陽性率蕎麥粉最高為10%,從均值上看,黃曲霉毒素AFs、AFB1二者均值最高的都為蕎麥面,均值分別為1.91、2.76 μg/kg,AFB2均值蕎麥茶最高為0.77 μg/kg,AFG1均值蕎麥飯最高為3.83 μg/kg,AFG2均值最高是蕎麥粉為0.38 μg/kg。從超標率看,不同加工類型的蕎麥食品AFs濃度范圍只有蕎麥面和蕎麥飯超過15 μg/kg,蕎麥面的濃度范圍1.60～24.60 μg/kg,蕎麥飯的濃度范圍為0～26.80 μg/kg,其他類型都低于15 μg/kg,根據美國食品藥品監督管理局對黃曲霉毒素在食品中的殘留限量規定為15 μg/kg,因此需要加強蕎麥面和蕎麥飯的監控和管理。

表5 不同加工類型的蕎麥食品黃曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2及AFS污染情況Table 5 Pollution of aflatoxin AFB1、AFB2、AFG1、AFG2 and AFS in buckwheat food of different processing types

2.4 不同地區以及不同加工類型蕎麥食品和黃曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2方差分析結果

從表6可以看出,AFB1在類型上差異性顯著(p<0.05),說明不同類型的蕎麥食品對AFB1含量有極顯著影響,黃曲霉毒素AFB2、AFG1、AFG2含量在類型上差異性不顯著(p>0.05)。從表7可知,蕎麥面的AFB1含量與其他類型AFB1含量有顯著差異,說明蕎麥面比其他類型的蕎麥食品AFB1更容易超標。黃曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2在地區間差異性不顯著(p>0.05)。不同地區所選的樣品數量和類型不一致,部分地區的樣品量和樣品類型選擇不足,由于西南地區是蕎麥的主產區,并且樣品數多,后期將展開西南地區不同類型對黃曲霉毒素的分析。

表6 類型以及地區間AFB1、AFB2、 AFG1、AFG2方差分析結果Table 6 Analysis results of variance of AFB1,AFB2, AFG1 and AFG2 in different types and regions

表7 各種類型AFB1含量均數的兩兩比較(S-N-K法,α=0.05)Table 7 Comparison of the AFB1 content averages between the various types(S-N-K method,α=0.05)

2.5 西南地區不同類型蕎麥食品和黃曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2方差分析結果

從表8可以看出西南地區不同加工類型的蕎麥食品和黃曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2差異性不顯著,西南地區影響黃曲霉毒素超標的主要原因推測可能是其他因素引起的。

表8 類型和AFB1、AFB2、AFG1、AFG2方差分析結果Table 8 Analysis results of variance of AFB1， AFB2,AFG1 and AFG2 in different types

2.6 收成月平均溫度、收成月平均降水量對四種黃曲霉毒素的影響

從表9可以看出,收成月平均溫度與AFB1呈極顯著正相關(r=0.41,p<0.01),說明收成月平均溫度越高,AFB1含量越高,收成月平均溫度與AFB2、AFG1、AFG2沒有顯著相關性(p>0.05)。收成月平均降水量與AFB1、AFB2、AFG1、AFG2差異性不顯著(p>0.05)。隨著AFB1含量的增加,AFG1的含量也增加,二者之間呈顯著正相關(r=0.30,p<0.05)。

表9 收成月平均溫度,收成月平均降水量、AFB1、AFB2、AFG1、AFG2間的相關關系Table 9 Correlation among monthly average temperature and monthly average precipitation in harvesting season,AFB1,AFB2,AFG1 and AFG2

3 討論與結論

我國于1972、1973、1974 及1981年先后在全國進行食品中 AFB1的普查工作,結果發現長江和長江以南地區黃曲霉毒素污染較北方各省污染較重[16],此次調查結果也顯示地址位置西南地區黃曲霉毒素污染比其他地區嚴重,只有西南地區超過美國食品藥品監督管理局黃曲霉毒素在食品中的殘留限量規定,其他地區沒有超過限量標準,王君等[17]從8個省份采集了花生及其花生樣品,調查結果顯示玉米中黃曲霉毒素的檢出率為70.27%,最高為1098.36 μg/kg,并有14.86%的玉米樣品中黃曲霉毒素AFB1含量超出國家及國際食品法典限量標準限量標準。黃湘東等[18]抽檢了88份大米、花生及其制品中,黃曲霉毒素總陽性率達62.5%,總超標率14.8%,其中花生渣污染最嚴重,陽性率為100.0%,超標率高達80.0%。蕎麥的陽性率34.92%,整體污染水平不高,僅有3.17%超過限量標準,但是蕎麥食品污染也不容忽視。長期處于黃曲霉毒素暴露的情況肝癌的發病率風險增高[19],應該嚴格把關各類蕎麥食品,對流通以及加工環節進行監督,從而降低食源性疾病發生的幾率,保證居民身體健康。

此次調查結果顯示,盡管蕎麥食品整體處于較低的黃曲霉毒素污染狀態,但是仍然有不合格現象,本文中黃曲霉毒素污染主要是AFB1和AFG1污染,分析地區和類型對黃曲霉毒素的影響,發現蕎麥面AFB1更容易超標,分析收成月平均溫度和平均降水量對黃曲霉毒素的影響,在一定范圍的溫度越高越容易產生AFB1,降低溫度可以減少AFB1的產生。并且AFB1和AFG1之間相互也有影響,隨著AFB1含量的增加,AFG1的含量也增加,以及AFB1和AFG1之間的相互的影響,均需進一步探索。黃曲霉毒素的污染及其程度受到各種因素的影響,包括糧食的地理位置、季節氣候、種類和數量、糧食收割后的儲藏條件等[20]。因為西南地區是主產區、樣品數多,黃曲霉毒素AFS濃度范圍大,黃曲霉毒素超標食品兩份都在西南地區,推測可能是兩份樣品含水量較高,在貯藏或者加工過程中更容易產生黃曲霉毒素,玉米,花生中也得到證實含水量高的作物黃曲霉毒素更容易產生和增加[21-23],本研究顯示加工產品的類型與黃曲霉超標有明顯關系,這為蕎麥黃霉素超標預防提供了方向。

我國食品中黃曲霉毒素限量標準與CAC、歐盟、日本、美國標準相比存在一定差異[24]。第一,新標準未涉及黃曲霉毒素(AFB1+AFB2+M1+M2)的總量標準,幾種毒性疊加效應方面的要求相對缺失;第二,新標準增加了食品類別,但與歐盟標準相比覆蓋面仍有缺失,尤其是缺乏針對不同用途的同類食品的區分。我國黃曲霉毒素研究花生和玉米的較多,對蕎麥食品黃曲霉毒素的研究較少,研究蕎麥食品的黃曲霉毒素的污染情況,為我國食品黃曲霉毒素限量標準提供了可參考的依據,建議增加食品中黃曲霉毒素總量的限值標準并將各種食品的限值進行細化。