次氯酸鈉對(duì)肉雞屠宰預(yù)冷清洗中沙門氏菌交叉污染的控制效果

肖興寧,汪 雯,張巧艷,張建民,廖 明,楊 華,李延斌

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(杭州), 浙江省植物有害生物防控省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,浙江杭州 310021; 2.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 310058; 3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東廣州 510642; 4.阿肯色大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程系,阿肯色州費(fèi)耶特維爾 72701)

沙門氏菌(Salmonella)是一種常見的人畜共患病原菌,畜禽感染沙門氏菌可引起豬霍亂、雞白痢等疾病,人感染沙門氏菌易造成腹瀉、發(fā)熱及腸道炎癥反應(yīng)[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì),我國70%～80%的細(xì)菌性食物中毒由沙門氏菌引起,每年病例約820萬[3-4],在引起沙門氏菌中毒的食物中,超過90%是畜禽產(chǎn)品[1-2]。調(diào)查顯示,我國生鮮零售雞肉中沙門氏菌平均污染率為52.3%[5]。肉雞屠宰環(huán)節(jié)的沙門氏菌交叉污染不容忽視,有研究表明,進(jìn)入屠宰場活禽沙門氏菌污染率為3%～4%時(shí),屠宰后污染率可升高至35%[6-7]。因此,減少屠宰加工環(huán)節(jié)微生物交叉污染,對(duì)保障產(chǎn)品安全具有重要意義。

肉雞屠宰加工過程包括淋雞、掛雞、宰殺、瀝血、浸燙、脫毛、掏膛、內(nèi)腔淋洗、預(yù)冷清洗等多個(gè)環(huán)節(jié),其中,預(yù)冷清洗水中殘留的細(xì)菌可遷移至未污染的雞肉表面,發(fā)生交叉污染,因此需在預(yù)冷水中添加殺菌劑進(jìn)行控制[8-9]。NaClO是一種高效廣譜的殺菌劑,其殺菌原理是其可在水中形成次氯酸,同細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)或破壞磷酸脫氫酶結(jié)構(gòu),使糖代謝失調(diào)而至細(xì)胞死亡[10-11]。在我國,NaClO是屠宰企業(yè)清洗環(huán)節(jié)的常用殺菌劑[12]。

目前,交叉污染研究主要集中在定量描述不同介質(zhì)間的細(xì)菌遷移數(shù)量,如豬舌在廚房切片過程中單增李斯特菌的交叉污染遷移數(shù)量[13],火腿在切片過程中基于遷移數(shù)量的交叉污染模型[14],以及在廚房加工中,雞肉中彎曲桿菌遷移數(shù)量的交叉污染模型[15]。關(guān)于交叉污染造成細(xì)菌污染率變化的研究較少。Jung等[16]用自來水、電解水、乳酸、檸檬酸等4種清洗方法對(duì)初始污染率為12.5%的萵苣進(jìn)行連續(xù)3批次清洗,計(jì)算每批次萵苣清洗后的細(xì)菌污染率。

交叉污染造成細(xì)菌污染率的變化是風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型中的重要輸入?yún)?shù)。雞肉沙門氏菌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型中鮮見預(yù)冷清洗交叉污染造成細(xì)菌污染率變化的相關(guān)數(shù)據(jù),NaClO濃度和初始污染率對(duì)多批次樣品清洗后沙門氏菌污染率的影響尚不明確[17-19]。因此,本實(shí)驗(yàn)?zāi)M不同NaClO濃度(0～70 mg/L)和初始污染率(25%～100%)條件下3批次雞肉清洗過程,研究清洗后雞肉沙門氏菌污染率與NaClO濃度的關(guān)系,為優(yōu)化預(yù)冷清洗工藝和雞肉沙門氏菌定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腦心浸液肉湯(Brain Heart Infusion Broth,BHI)、緩沖蛋白胨水(Buffered Peptone Water,BPW)、木糖-賴氨酸-硫酸四癸鈉瓊脂(Xylose Lysine Tergitol 4,XLT4)培養(yǎng)基 美國BD公司;亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(Selenite Cystine Broth,SC) 青島海博生物技術(shù)公司;NaClO溶液 生工生物工程(上海)股份有限公司;斯坦利沙門氏菌(Salmonellastanley)、印第安納沙門氏菌(Salmonellaindiana)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、湯卜遜沙門氏菌(Salmonellathompson)、肯塔基沙門氏菌(Salmonellakentucky) 五株菌均分離于廣州某屠宰場,菌株保存于含有20%甘油的腦心浸液肉湯中,儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱備用,由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院提供;雞胸肉 購置于浙江省杭州市樂購超市。

Thermo Fisher 1389生物安全柜 英國Waltham公司;HVA-85 高壓滅菌鍋 日本Hirayama公司;KB240恒溫恒濕培養(yǎng)箱 德國Binder公司;Seward 400拍打式均質(zhì)機(jī) 英國Seward公司;WASP 2螺旋接種儀 英國Don Whitley Scientific公司;ProtoCOL3全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀 英國Synbiosis公司;10～1000 μL移液槍 德國Eppendorf公司;CS180百靈達(dá)余氯傳感儀 英國Palintest公司;CR400手持式色差儀 日本ChromaMeter公司;Hitachi 7650透射電子顯微鏡 日本Hitachi公司;TX150水浴鍋 英國Grant公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雞肉的預(yù)處理 雞胸肉冰鮮運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室,切塊分裝于自封袋中,單塊重量約25 g(5 cm×3 cm×2 cm),儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱內(nèi)。實(shí)驗(yàn)前取出放置于4 ℃冰箱解凍并在生物安全柜中紫外滅菌30 min后備用。紫外滅菌后的雞肉樣本中未有沙門氏菌檢出。

1.2.2 菌懸液制備及雞肉接種 5株菌株分別接種至5 mL BHI液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,將菌液等體積均勻混合,制得25 mL菌種原液,約9 lg CFU/mL。用BPW稀釋菌種原液,使初始接種液濃度約為7lg CFU/mL。將雞肉浸泡于接種液中30 min,轉(zhuǎn)移至無菌稱量盤,在生物安全柜內(nèi)靜置30 min,確保細(xì)菌附著在雞肉表面。雞肉表面初始接種水平約為5lg CFU/g。

1.2.3 雞肉預(yù)冷清洗

1.2.3.1 不同濃度NaClO的預(yù)冷清洗 實(shí)驗(yàn)前,將水浴鍋水溫調(diào)節(jié)至4 ℃。分別取濃度為0.8 g/mL的NaClO溶液0、238、595、833 μL溶于1 L預(yù)冷水中,制備NaClO濃度為0、20、50、70 mg/L的預(yù)冷水,不含NaClO的預(yù)冷水清洗為對(duì)照組。以對(duì)照組為例,將4塊接種后的雞肉(初始污染率為100%)放入NaClO濃度為0 mg/L的燒杯中清洗20 min后取出;不更換預(yù)冷水,將第二批共4塊無菌雞肉放入水中清洗20 min;再將第三批共4塊無菌雞肉放入預(yù)冷水中清洗20 min,即完成雞肉初始污染率為100%,NaClO濃度為0 mg/L的3批次雞肉連續(xù)預(yù)冷清洗。20、50、70 mg/L NaClO預(yù)冷水清洗過程同對(duì)照組操作,整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3.2 不同初始污染率的預(yù)冷清洗 研究3種初始污染率(25%、50%、100%)雞肉預(yù)冷清洗(NaClO濃度為50 mg/L)后的細(xì)菌污染率,不含NaClO的預(yù)冷水清洗為對(duì)照組。以初始污染率為25%,NaClO濃度為0 mg/L實(shí)驗(yàn)為例,將含有1塊接種雞肉的4塊雞肉(初始污染率為25%)放入NaClO濃度為0 mg/L的預(yù)冷水中清洗20 min后取出;不更換預(yù)冷水,將第二批共4塊無菌雞肉放入水中清洗20 min;再將第三批共4塊無菌雞肉放入預(yù)冷水中清洗20 min,即完成初始污染率為25%,NaClO濃度為0 mg/L的3批次雞肉連續(xù)預(yù)冷清洗。其余5組(25%,50 mg/L;50%,0 mg/L;50%,50 mg/L;100%,0 mg/L;100%,50 mg/L)清洗實(shí)驗(yàn)操作同對(duì)照組處理,整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 指標(biāo)測定

1.2.4.1 預(yù)冷水中細(xì)菌測定 取1 mL清洗后預(yù)冷水于無菌離心管,充分震蕩后,吸取50 μL采用螺旋涂布法涂布于XLT4瓊脂培養(yǎng)基中,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h,使用全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)。當(dāng)樣本中細(xì)菌濃度低于涂布法定量限(20 CFU/mL)時(shí),采用增菌富集法定性測定樣本中是否含有沙門氏菌殘留。取1 mL預(yù)冷水至9 mL SC增菌液中,37 ℃,12 h培養(yǎng)后吸取10 μL增菌液涂布于XLT4瓊脂培養(yǎng)基中,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)16～18 h,若平板長出黑色菌落,則判定預(yù)冷水中有沙門氏菌殘留。

1.2.4.2 清洗后雞肉污染率測定 清洗后雞肉樣本轉(zhuǎn)移至含有25 mL BPW的均質(zhì)袋中,以250 r/min速度拍打1 min,取1 mL均質(zhì)液至9 mL SC增菌液中,37 ℃培養(yǎng)12 h。取10 μL增菌液涂布于XLT4瓊脂培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng)16～18 h,若平板長出黑色菌落,則判斷為沙門氏菌陽性樣本。每批次雞肉清洗后沙門氏菌污染率(Pn,%)及雞肉全部清洗后總污染率(P,%)計(jì)算如公式(1)～(2)所示。

式(1)

式中:Mn第n批次雞肉清洗后沙門氏菌陽性樣本量(n=0,1,2,3),Nn為每批次雞肉樣本量。當(dāng)n=0時(shí),P0為初始污染率即第一批次雞肉清洗前細(xì)菌污染率(%);當(dāng)n=1時(shí),P1為第一批次雞肉清洗后的細(xì)菌污染率(%);當(dāng)n=2時(shí),P2為第二批次雞肉清洗后的細(xì)菌污染率(%);當(dāng)n=3時(shí),P3為第三批次雞肉清洗后的細(xì)菌污染率(%)。

式(2)

式中:M為3批次雞肉全部清洗后的沙門氏菌陽性樣本量,N為3批次雞肉樣本總量。

1.2.4.3 雞肉色澤測定 本實(shí)驗(yàn)測定了第一批雞肉NaClO(0、20、50、70 mg/L)預(yù)冷清洗前后的色澤變化。以色差儀測量雞肉表面的色澤變化指標(biāo)值(ΔL,Δa,Δb)。其中,ΔL表示亮度值,Δa表示紅度值,Δb表示黃度值。每個(gè)樣品平行測定5次,整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4.4 透射電子顯微鏡樣品制備與觀察 為研究細(xì)菌在不同濃度NaClO處理下的細(xì)胞損傷程度。雞肉在0、20、50、70 mg/L的NaClO中清洗后取出,用刀片在雞肉樣本上取尺寸為3 mm×1 mm×1 mm大小的雞肉塊。采用2.5%戊二醛和1%四氧化鋨雙重固定雞胸肉樣品,乙醇梯度脫水,樹脂包埋,切片后經(jīng)檸檬酸鉛和醋酸雙氧鈾雙重染色,透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,采用Origin 8.1軟件進(jìn)行作圖分析。采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,通過一元方差分析(Oneway ANOVA)進(jìn)行多個(gè)組間平均數(shù)的比較。若組間存在顯著性差異,采用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行組間多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaClO濃度對(duì)清洗后雞肉沙門氏菌污染率的影響

由表1可知,當(dāng)預(yù)冷水中未添加NaClO時(shí),第一批雞肉清洗后污染率仍為100%,第二、三批無菌雞肉清洗后污染率分別為91.7%和83.3%,表明低溫清洗(4 ℃)對(duì)沙門氏菌交叉污染抑制效果不明顯,細(xì)菌可通過預(yù)冷水遷移至后續(xù)清洗的雞肉樣本[21]。添加NaClO后,沙門氏菌通過預(yù)冷水遷移至第二批雞肉的概率降低,且第三批無菌雞肉在20～70 mg/L的NaClO中清洗后未發(fā)生沙門氏菌污染,表明NaClO可一定程度上減少預(yù)冷水中細(xì)菌殘留量,從而減少細(xì)菌遷移[16]。對(duì)預(yù)冷水中細(xì)菌污染水平測定結(jié)果顯示(表2),當(dāng)未添加NaClO時(shí),清洗后預(yù)冷水中沙門氏菌的污染水平為4lg CFU/mL。當(dāng)NaClO濃度為20 mg/L時(shí),清洗后預(yù)冷水中沙門氏菌污染水平低于定量限(20 CFU/mL),但增菌后有沙門氏菌檢出。當(dāng)NaClO濃度為50和70 mg/L時(shí),增菌后預(yù)冷水中未檢出沙門氏菌?？梢?預(yù)冷水中NaClO濃度(50 mg/L時(shí),可有效抑制多批次雞肉清洗過程的交叉污染。

表1 不同NaClO濃度清洗后的雞肉沙門氏菌污染率(%)Table 1 Post-chill prevalence of Salmonella on chicken samples at different chlorine concentration(%)

表2 雞肉全部清洗后的預(yù)冷水中的細(xì)菌存活數(shù)量Table 2 Bacterial survival in chilling water

2.2 初始污染率對(duì)交叉污染的影響

由表3可知,當(dāng)預(yù)冷水中未添加NaClO和NaClO添加濃度為50 mg/L時(shí),樣品初始污染率對(duì)交叉污染影響均不顯著(p>0.05)。未添加NaClO時(shí),各種初始污染率的雞肉清洗后污染率均較高;NaClO添加濃度為50 mg/L時(shí),可控制各種初始污染率雞肉樣品在清洗中的交叉污染。Maffei等[22]研究了沙門氏菌污染率分別為9.0%、16.7%、50.0%的生菜清洗后的細(xì)菌污染率變化,同樣未發(fā)現(xiàn)初始污染率對(duì)交叉污染的影響。Yang等[21]的研究也表明NaClO濃度為50 mg/L時(shí),可有效控制預(yù)冷清洗中初始污染率為3.0%～43.3%雞肉沙門氏菌的交叉污染。

表3 不同初始污染率條件下清洗后的雞肉沙門氏菌污染率Table 3 Post-chill prevalence of Salmonella on chicken samples at different initial pre-chill prevlence

2.3 NaClO清洗對(duì)雞肉色澤的影響

不同濃度NaClO清洗后的雞肉色澤變化如表4所示。清洗后的雞肉表面亮度值、紅度值、黃度值未發(fā)生顯著性變化(p>0.05),表明預(yù)冷清洗中使用濃度低于70 mg/L NaClO,不會(huì)造成雞肉色澤變化。NaClO氧化性對(duì)食品色澤影響可能與濃度和食品基質(zhì)相關(guān)。王凱利等[23]研究發(fā)現(xiàn)250 mg/L NaClO處理對(duì)雞肉色澤變化沒有顯著性影響。孫靜等[24]研究發(fā)現(xiàn),1000 mg/L NaClO處理后鴨蛋殼的表面亮度顯著增大。

表4 雞肉處理前后色澤變化Table 4 Changes in color of chicken samples treated with different NaClO concentrations

2.4 NaClO清洗后雞肉表面細(xì)菌透射電鏡圖

不同濃度NaClO(0、20、50、70 mg/L)處理后的雞肉表面沙門氏菌細(xì)胞狀態(tài)如圖1所示,0 mg/L的NaClO處理后的沙門氏菌細(xì)胞壁及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整,電子密度較高,胞漿內(nèi)電子密度均一(圖1A)。經(jīng)20、50、70 mg/L的NaClO處理后,細(xì)菌細(xì)胞壁和胞漿內(nèi)電子密度均降低，菌體細(xì)胞壁及細(xì)胞膜斷裂,核心溶解(圖1B～圖1D)[25]，菌體均受到一定程度的破壞。

圖1 不同濃度NaClO處理下的沙門氏菌透射電鏡圖(5000×)Fig.1 Transmission electron microscope photographs of Salmonella treated with different concentrations of NaClO(5000×)注：A、B、C、D分別是0、20、50、70 mg/mL NaClO處理的沙門氏菌。

3 討論與結(jié)論

交叉污染是造成食品致病菌污染、引發(fā)食品安全事件的重要因素之一[26],加強(qiáng)交叉污染對(duì)食品中細(xì)菌污染率、污染水平變化規(guī)律的研究,對(duì)開展微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有重要意義。本研究針對(duì)雞肉屠宰預(yù)冷清洗環(huán)節(jié)的連續(xù)清洗過程,研究了NaClO濃度(0～70 mg/L)和初始污染率(25%～100%)對(duì)交叉污染的影響,發(fā)現(xiàn)添加NaClO可有效抑制多批次雞肉清洗過程中的沙門氏菌交叉污染,且濃度≥50 mg/L時(shí),預(yù)冷水中無沙門氏菌殘留,可減小交叉污染風(fēng)險(xiǎn)。

目前,肉雞沙門氏菌的定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型普遍未考慮預(yù)冷環(huán)節(jié)多批次清洗過程中交叉污染造成的沙門氏菌污染率變化。Yang等[21]研究了單批次預(yù)冷清洗中不同氯濃度清洗后的雞肉沙門氏菌污染率變化,不適用于多批次清洗的交叉污染情況。Whyte等[27]評(píng)價(jià)了二氯異氰尿酸鈉在肉雞預(yù)冷清洗過程中對(duì)交叉污染的控制效果,Park等[28]研究了電解水對(duì)肉禽清洗中彎曲桿菌交叉污染的控制效果,然而,在我國肉雞屠宰質(zhì)量管理規(guī)范中(NY/T 1174-2006),NaClO是唯一允許在屠宰預(yù)冷環(huán)節(jié)使用的殺菌劑。前人的研究均無法為我國肉雞屠宰沙門氏菌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。因此,本研究對(duì)我國肉雞預(yù)冷清洗環(huán)節(jié)沙門氏菌污染控制、開展沙門氏菌定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有重要意義。本研究為實(shí)驗(yàn)室模擬實(shí)驗(yàn),未來需在中試規(guī)模下進(jìn)行大樣本驗(yàn)證。此外,本研究未涉及清洗后雞肉細(xì)菌污染率與清洗批次、氯濃度及初始污染率等因素之間的定量模型,需在下一步研究中進(jìn)行探索。