低溫連續相變萃取對藍圓魚蛋白結構的影響及其抗氧化肽制備工藝優化

王淑惠,羅旭洸,王 爽,周愛梅,曹 庸

(華南農業大學食品學院,廣東省天然活性物工程技術研究中心, 廣東省功能食品活性物重點實驗室,廣東廣州 510642)

藍圓鲹(Decapterusmaruadsi),又稱為巴浪魚、池魚,為鲹科(Carangidae)圓鲹屬(Decapterus),其廣泛分布于中國南海、東海和臺灣海域,是我國主要的經濟魚類之一[1-2],具有形體小、產量大、營養豐富等特點[3],其中藍圓鲹粗蛋白干重含量為80.16%,粗脂肪干重含量為10.38%[4]。但藍圓鲹的漁獲期在夏季,魚體顏色深,容易發生腐敗產生不愉快的氣味,因此常被丟棄或者加工成魚粉或肥料等低值副產品[5]。越來越多的研究報道,將低值海洋魚類加工成高價值的產品,如魚糜以及具有生物活性的蛋白質水解產物,有利于充分開發海洋資源[6-9]。目前對藍圓鲹的開發利用尚不充分,若能將藍圓鲹的資源進行綜合利用,將具有重要的經濟效益。

低溫連續相變萃取[10]是在超臨界、亞臨界萃取技術的基礎上由本研究團隊自主研發的一種新型食品加工技術,萃取時在較低的溫度下進行,可以對物料進行連續的逆流萃取,且不會對樣品中的目標成分和熱敏性成分造成損害,得到的萃取殘渣溶劑殘留少,富含蛋白質[11]。目前關于低溫連續相變萃取魚油后對蛋白質結構和活性影響的研究尚未見報道。故本研究利用該技術提取魚油后得到的脫脂藍圓鲹魚粉作為原料,研究該技術對脫脂藍圓鲹魚粉中蛋白二級結構的影響。

蛋白質的二級結構是反映蛋白質是否發生變性的重要體現[12],某些物理、化學因素都會使蛋白質的空間結構發生明顯的變化,從而導致其生物活性的喪失[13]。基于此,本文采用傅里葉紅外光譜、圓二色光譜兩種方法來表征低溫連續相變萃取技術對脫脂藍圓鲹魚粉中的蛋白質微觀結構變化,并進一步以脫脂藍圓鲹魚粉為原料,利用堿性蛋白酶制備抗氧化肽,優化其制備工藝,為藍圓鲹的綜合利用提供有益的參考。因此,對脫脂藍圓鲹魚粉進行加工利用對南海低值魚高值化綜合利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮藍圓鲹 廣州市天河區長湴市場;丁烷(99.99%) 廣州深巖燃氣有限公司;堿性蛋白酶(1.925×105U/g) 廣州市齊云生物技術有限公司;DPPH(1,1-二苯基-2-苦基肼自由基) 美國Simga-Aldrich貿易有限公司;其余試劑 均為分析純。

LSC-60D型水分測定儀 沈陽龍騰電子有限公司;HYP-308型消化爐、KDN-103F型凱氏定氮儀 上海纖檢儀器有限公司;SRJX-8-13型高溫馬弗爐 北京市永光明醫療儀器廠;DHG-970型鼓風干燥箱 上海齊心科學儀器有限公司;3L、21L低溫連續相變萃取裝置 珠海共同機械有限公司;VERTEX 70型傅立葉紅外光譜儀 德國BRUKER;AL104型萬分之一電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;Chirascan型圓二色光譜分析儀 英國應用光物理公司;Enspire2300酶標儀 美國Perkin Elmer公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 脫脂藍圓鲹魚粉的制備 將去除內臟部分的新鮮藍圓鲹在45 ℃烘箱內干燥至含水量為10%左右,粉碎后過120目篩得到藍圓鲹魚粉。參照楊小斌等[14]的方法,利用低溫連續相變技術提取藍圓鲹魚油,得到的萃取殘渣即為脫脂藍圓鲹魚粉,過120目篩后用于后續研究。

1.2.2 基本成分分析 分別對新鮮藍圓鲹、藍圓鲹魚粉和脫脂藍圓鲹魚粉的水分、灰分、蛋白質、脂肪等基本成分進行測定。其中水分的測定采用直接干燥法,具體操作按照國標GB 5009.3-2010食品中水分的測定[15];灰分的測定按照國標GB 5009.4-2010食品中灰分的測定[16];蛋白質測定采用凱氏定氮法,具體操作按照國標GB 5009.5-2010食品中蛋白質的測定[17];粗脂肪的測定按照國標GB 5009.6-2016食品中粗脂肪的測定[18]。

1.2.3 傅里葉變換紅外光譜分析 采用溴化鉀壓片法[19],對脫脂藍圓鲹魚粉和藍圓鲹魚粉采用傅立葉變換紅外光譜儀進行紅外掃描分析。將樣品置于40 ℃烘箱中充分干燥至恒重,取1 mg恒重樣品與100 mg溴化鉀混合研磨進行壓片,以100 mg溴化鉀磨碎進行壓片作為空白背景,進行全波段(4000～400 cm-1)掃描,每次試驗對信號進行32次掃描,分辨率為4 cm-1,扣除背景后得到紅外光譜圖。利用OMNIC數據處理軟件校正,限制譜帶范圍為1600～1700 cm-1[20];用Peakfit軟件將譜圖進行兩點基線校正,再進行二階導數擬合。根據各指認峰積分面積計算出各種二級結構的相對百分含量。

1.2.4 圓二色譜測定 對脫脂藍圓鲹魚粉和藍圓鲹魚粉進行溶解,配制成濃度為0.2 mg/mL的樣品溶液。設置圓二色儀器的溫度為24.7 ℃,掃描范圍為190～260 nm,將樣品放置于1 mm的比色皿中,放入圓二色譜儀中進行掃描,得到去除背景的圓二色的光譜曲線[21]。

1.2.5 堿性蛋白酶酶解脫脂藍圓鲹魚粉制備抗氧化肽的研究

1.2.5.1 酶解工藝的單因素實驗 以DPPH自由基清除率為指標,研究溫度、pH、料液比和加酶量對酶解物DPPH自由基清除率的影響。

固定反應條件:料液比為1∶30 (w/v),加酶量為8000 U/g·pro,pH9.0,酶解時間為6 h,考察不同溫度45、50、55、60、65 ℃對酶解物DPPH自由基清除率的影響。

固定反應條件:料液比為1∶30 (w/v),加酶量為8000 U/g·pro,溫度為55 ℃,酶解時間為6 h,考察不同pH8.5、9.0、9.5、10.0、10.5對酶解物DPPH自由基清除率的影響。

固定反應條件:溫度為55 ℃,加酶量為8000 U/g·pro,pH9.5,酶解時間為6 h,考察不同料液比1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶50 (w/v)對酶解物DPPH自由基清除率的影響。

固定反應條件:溫度為55 ℃,料液比為1∶30 (w/v),溫度為55 ℃,pH9.5,酶解時間為6 h,考察不同加酶量2000、4000、6000、8000、10000 U/g·pro對酶解物DPPH自由基清除率的影響。

1.2.5.2 酶解工藝的正交試驗 在單因素試驗的基礎上,料液比、酶解溫度、加酶量這三個因素是影響抗氧化指標的主要因素,選擇確定的pH9.5,以DPPH自由基清除率為指標,設計L9(34)正交表,實驗因素及水平見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experimental

1.2.6 DPPH自由基清除率的測定 參照Sampath等[22]的方法,并適當改進。吸取100 μL待測液于96孔板中,加入100 μL DPPH溶液(0.2 mmol/L,溶于95%乙醇),混合均勻后,于室溫下避光放置30 min,隨后在517 nm處測定其吸光值,記為A1,將100 μL DPPH溶液和100 μL 95%乙醇混合,其它操作同A1,記為A0;將100 μL待測液和100 μL 95%乙醇混合,其它操作同A1,記為A2;按照下式計算DPPH自由基清除率。

式中:A0表示100 μL 95%乙醇+100 μL DPPH溶液的吸光值;A1表示100 μL待測液+100 μL DPPH溶液的吸光值;A2表示100 μL待測液+100 μL 95%乙醇的吸光值。

1.3 數據處理

實驗數據以均值±標準差來表示,采用SPSS 17.0統計軟件進行單因素方差分析,Origin 8.5軟件作圖,peakfit軟件處理傅里葉紅外數據,CDNN分析圓二色譜數據。

2 結果與分析

2.1 基本成分分析

由表2可以看出,新鮮藍圓鲹中主要為水分,約占原料中的77.87%,其余主要為蛋白質(17.17%)及脂肪(3.53%);而在對新鮮藍圓鲹進行干燥后,蛋白質及脂肪成為原料中主要成分,約占80%～86%;脫脂藍圓鲹魚粉的主要成分為蛋白質(88.78%),顯著高于新鮮藍圓鲹(17.17%)及藍圓鲹魚粉(73.81%)樣品中的蛋白質含量(p<0.05)。脫脂藍圓鲹魚粉中灰分為4.29%,顯著高于新鮮藍圓鲹中灰分(1.05%)含量(p<0.05),原因可能是藍圓鲹在提取魚油后其無機物如礦物質的含量殘留多。上述結果說明,藍圓鲹經低溫連續相變技術提取魚油后,其脫脂魚粉富含蛋白質,可進一步綜合利用。

表2 藍圓鲹脫脂前后基本成分比較Table 2 Comparison of basic components before and after defatting of Decapterus maruadsi

2.2 傅里葉紅外光譜分析

紅外光譜的定量分析依據是比耳定律,由于不同基團振動頻率的吸光度系數差異不同,故而不同基團的特征吸收峰就相差很大。因此傅里葉紅外光譜可以用于測定物質特性及其相互作用,分析低溫連續相變對藍圓鲹蛋白質結構的影響,其傅里葉變換紅外光譜分析如圖1所示。

圖1 藍圓鲹魚粉脫脂前后的紅外光譜Fig.1 FT-IR spectrum of before and after defatting Decapterus maruadsi powder注:A:脫脂藍圓鲹魚粉;B:藍圓鲹魚粉。

通過紅外光譜的掃描分析,可以顯示出各物質的分子結構和具有特征性的化學鍵。從圖1可以看出,藍圓鲹魚粉脫脂前的圖譜與藍圓鲹魚粉脫脂后的圖譜基本相似,主要區別就是特征峰的峰高和峰面積有所不同,它們兩者都在3600～3100 cm-1范圍內出現大波段吸收峰,說明里面都含有大量的具有伸縮振動的吸收峰-OH,由于-OH是個強極性基團,因此羥基化合物的締合現象非常顯著;1690～630 cm-1為C=O的伸縮振動吸收峰,由于氮原子上未共用電子對與羰基的鍵進行共軛,從而使其在此范圍內有振動;1650～500 cm-1為N-H的面內彎曲振動吸收峰;1440～360 cm-1為-COO的對稱伸縮振動,強度弱于反對稱伸縮振動吸收,并且常是兩個或三個較寬的峰。1330～1050 cm-1為C-O-C的對稱伸縮振動吸收峰。1140～1030 cm-1為C-O的酯類伸縮振動吸收峰;在1250～800 cm-1范圍內,是C-C的震動,特征性不強。與脫脂藍圓鲹魚粉相比,藍圓鲹魚粉在2929.42與1739.28 cm-1處有峰值的變化,在2975～2845 cm-1范圍內是飽和的C-H伸縮振動,也包括甲基、亞甲基和次甲基的對稱與不對稱伸縮振動;在1740～1720 cm-1范圍內,是羰基的伸縮振動。除此之外,其余的特征峰沒有太大不同,只是峰面積不同。由此可以初步斷定,藍圓鲹魚粉在經過低溫連續相變技術脫脂后,其蛋白質結構沒有發生變化。

肽鍵作為一種酰胺鍵,它在紅外光區有其特征吸收峰。酰胺Ⅰ的吸收峰范圍是1700～1600 cm-1;酰胺Ⅱ的吸收峰范圍是1550～1450 cm-1;酰胺Ⅲ的吸收峰范圍是1300～1200 cm-1[23]。在研究蛋白質構象的變化中,酰胺Ⅰ帶主要包含了C=O的伸縮振動,這對蛋白質二級結構的變化十分敏感,對于研究蛋白質二級是否發生變化很有價值[24]。為了進一步研究低溫連續相變技術對藍圓鲹魚粉中蛋白二級結構的影響,利用去卷積方法對酰胺Ⅰ帶進行擬合,結果如圖2～圖3所示。

圖2 藍圓鲹魚粉酰胺I帶的紅外(上)和高斯曲線擬合圖譜(下)Fig.2 Decapterus maruadsi powder FTIR spectrum of amide I(up)and Gaussian multiple peaking fitting analysis for the peaks(down)

圖3 脫脂藍圓鲹魚粉酰胺I帶的紅外(上)和高斯曲線擬合圖譜(下)Fig.3 Defatted Decapterus maruadsi powder FTIR spectrum of amide I(up)and Gaussian multiple peaking fitting analysis for the peaks(down)

采用高紅艷等[25]的譜帶指認進行確定指認范圍:1610～1640 cm-1為β-折疊;1650～1660 cm-1為α-螺旋;1640～1650 cm-1為無規則卷曲;1660～1695 cm-1為β-轉角,譜帶指認結果如表3所示。

由圖2～圖3和表3可知,藍圓鲹魚粉中的蛋白質包含四種結構:β-折疊、無規則卷曲、α-螺旋、β-轉角。α-螺旋和β-折疊屬于相對規則的構象,多數存在于蛋白質的內部,這兩種結構中分布著較多的氫鍵,能與其它基團發生氫鍵鍵合,使得蛋白質的二級結構趨于規則,從而具有一定的剛性,β-轉角和無規則卷曲中不存在氫鍵或其它相互作用,使分子表現出較大的柔性[26]。與藍圓鲹魚粉的蛋白相比,脫脂藍圓鲹魚粉的蛋白中β-折疊含量減小了0.52%,無規則卷曲減少了0.22%,α-螺旋增加了0.55%,β-轉角增加了0.09%。有學者研究,在一般情況下,蛋白質會隨著溫度的改變,α-螺旋的含量會大幅度變化[27],而在經過低溫連續相變技術提取魚油之后,脫脂藍圓鲹魚粉的蛋白中α-螺旋僅增加了0.55%,說明在此溫度條件下,蛋白質分子之間并沒有發生反應,故而氫鍵作用力并沒有被破壞[28]。經過低溫連續相變提取魚油之后得到的脫脂藍圓鲹魚粉,其蛋白的剛性結構從50.42%增加了50.55%,柔性結構從49.58%減少到49.45%,說明低溫連續相變技術可以使藍圓鲹蛋白的二級結構趨于規則,其剛性增加,穩定性也有明顯提高。

2.3 圓二色光譜分析

圓二色譜(CD)是一種電子吸收光譜,也是研究溶液中蛋白質結構的一種比較快速且簡單的方法,通過圖譜可以得到其手性特征,可以根據在190～260 nm處的吸收值可以得出其內部的二級結構,該技術在食品中已廣泛應用。將藍圓鲹魚粉溶液及脫脂藍圓鲹魚粉溶液放入圓二色譜儀中進行光譜掃描,結果如圖4所示,從圖4中可以得出,兩者的CD譜圖相差不大,在經過低溫連續相變技術提取魚油之后,脫脂藍圓鲹魚粉的蛋白保持了完整的三級結構,且結構沒有發生明顯變化。

經過CDNN軟件分析得知,藍圓鲹魚粉及脫脂藍圓鲹魚粉的蛋白均含有四種二級結構,其組成如圖5所示。從圖中可以看出,藍圓鲹魚粉的蛋白二級結構包含有β-折疊、無規則卷曲、α-螺旋和β-轉角四種。其中,在β折疊中,由于氫鍵幾乎都垂直于伸展的肽鏈,這些肽鏈分為平行排列(走向由N到C方向),或者是反平行排列。藍圓鲹魚粉的蛋白反平行排列所占比例較高,說明藍圓鲹魚粉中的蛋白主要是由氫鍵進行連接的。從圖5中可以看出,藍圓鲹魚粉在提取魚油后其蛋白質二級結構中各比例基本處于不變的狀態,說明其肽鏈中主鏈原子的局部空間排布沒有發生改變,即空間構象沒有變化,因而也從微觀上驗證了藍圓鲹魚粉在經過低溫連續相變技術提取魚油后,其蛋白質內部結構沒有發生改變。

圖5 藍圓鲹魚粉脫脂前后的蛋白質二級結構所占比例Fig.5 Proportion of the secondary structure of before and after defatting Decapterus maruadsi powder注:不同字母表示差異顯著(p<0.05);圖6～圖9同。

2.4 脫脂藍圓鲹魚粉的酶解單因素實驗結果

2.4.1 溫度對酶解液DPPH自由基清除率的影響 由圖6可知,隨著溫度的增加,酶解液中的DPPH自由基清除率呈現先增加后下降的趨勢,在溫度為55 ℃下達到最大值(85.67%),超過55 ℃時,其清除率呈現下降的趨勢(p<0.05)。這表明在酶促反應中,酶分子不斷吸收能量,當溫度持續升高,酶分子的次級鍵因吸收過多能量而斷裂,導致酶蛋白結構變性,酶活性喪失,并且藍圓鲹蛋白自身也發生變性,使得生成的抗氧化肽減少,DPPH自由基清除率降低[29];同時溫度從55 ℃上升至70 ℃,導致已生成的具有較好抗氧化活性多肽被降解,抗氧化活性變弱,從而致使DPPH自由基清除率下降[30]。張建賀等[31]在利用堿性蛋白酶酶解苜蓿葉蛋白時得到同樣的結果,當酶解溫度為55 ℃時,得到的苜蓿葉蛋白抗氧化肽的DPPH自由基清除率最高。因此,選擇酶解溫度為55 ℃。

圖6 溫度對酶解物DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Effect of temperature on DPPH free radical scavenging rate of enzymatic hydrolysate

2.4.2 pH對酶解液DPPH自由基清除率的影響 堿性蛋白酶的最適pH范圍是8～10,其催化能力與環境的pH有密切關系,而pH的變化也會影響酶反應中酶分子和底物之間的解離狀態,從而影響酶解反應速率[32-33]。由圖7可知,酶解液的DPPH自由基清除率隨著pH的增加而呈現先增加后降低的趨勢,在pH為9.5時達到最大值(85.89%),但在pH為9.0～10.0之間的值差異不顯著(p>0.05)。說明當pH大于9.5時,堿性蛋白酶的活性降低,導致酶的催化效率下降,降低DPPH自由基清除率。因此,選擇pH9.5為最佳酶解pH。

圖7 pH對酶解物DPPH自由基清除率的影響Fig.7 Effect of pH on DPPH free radical scavenging rate of enzymatic hydrolysate

2.4.3 料液比對酶解液DPPH自由基清除率的影響 料液比的不同,對酶反應的最佳結果也不盡相同。由圖8可知,隨著料液比的增加,酶解液中的DPPH自由基清除率呈現先增加后降低的趨勢,且在料液比為1∶30 (w/v)達到最大值(86.87%),與其他料液比條件下的值相比有顯著性差異(p<0.05)。由于初始底物濃度過高,過量的底物大量集聚在酶分子表面,降低酶解的效率,DPPH自由基清除率低;當料液比為1∶30 (w/v)時,底物濃度適中,酶的催化效率最高,DPPH自由基清除率最高;而當液體的量逐漸增加時,底物濃度和酶的濃度都在降低,使酶解效率下降[34],從而導致DPPH自由基清除率又下降。因此,確定酶解的最佳料液比為1∶30 (w/v)。

圖8 料液比對酶解物DPPH自由基清除率的影響Fig.8 Effect of ratio of water to material on DPPH free radical scavenging rate of enzymatic hydrolysate

2.4.4 加酶量對酶解液DPPH自由基清除率的影響 一般認為,酶反應過程中加酶量的不同,其反應速度也呈現相應的變化,且成正相關的變化。由圖9可知,在加酶量為4000～6000 U/g·pro范圍內,隨著加酶量的增加,DPPH自由基清除率增加差異不明顯(p>0.05),當加酶量為8000 U/g·pro時,酶解液中的DPPH自由基清除率達到最大值(86.67%)。結果表明,當底物濃度足夠大時,酶促反應速率隨著加酶量的增加而增加。當酶濃度增大到一定濃度時,反應體系中底物消解達到飽和,酶解效率將不再上升甚至會降低。同時,過多的酶會酶解生成的多肽,與蛋白質競爭蛋白酶的作用位點,進而被水解為寡肽或氨基酸,所以當加酶量增加到8000 U/g·pro時,酶解液的DPPH自由基清除率開始下降,由此可推斷具有較強抗氧化活性的多肽其氨基酸構成較多,而非寡肽或氨基酸[34]。因此,選擇最適加酶量為8000 U/g·pro。

圖9 加酶量對酶解物DPPH自由基清除率的影響Fig.9 Effect of the amount of enzyme on DPPH free radical scavenging rate of enzymatic hydrolysate

根據單因素實驗結果,料液比、溫度和加酶量是影響藍圓鲹抗氧化肽DPPH自由基清除率的主要因素。從圖7中可看出,在pH分別為9.0、9.5和10.0時,DPPH自由基清除率沒有顯著性差異,但在pH9.5時自由基清除率最高。故選取確定的pH9.5,選擇料液比、溫度和加酶量三個因素進行正交試驗優化。

2.5 正交實驗結果及方差分析

為了得到DPPH自由基清除率最高的脫脂藍圓鲹魚粉的蛋白酶解物,在堿性蛋白酶酶解單因素結果的基礎上,對其進行最適水解條件的優化,選擇料液比(A)、酶解溫度(B)、加酶量(C)三個因素為考察指標,采用L9(34)正交試驗設計,確定酶解時間為6 h,pH為9.5,進行抗氧化肽的最佳酶解工藝優化,正交試驗結果見表4。

表4 L9(34)正交試驗結果表Table 4 L9(3)4 orthogonal experiment result table

由正交試驗結果可知,不同因素對酶解液中抗氧化活性的影響為:A>B>C。以DPPH自由基清除率為指標,得出最佳的酶解方案為A1B1C2,即在酶解料液比為1∶25 (w/v),酶解溫度為50 ℃,加酶量為8000 U/g·pro時,在此條件下的DPPH自由基清除率最高,達到89.99%±0.13%,因此選擇此條件進行酶解制備脫脂藍圓鲹抗氧化肽。

3 結論

本文首次研究了采用低溫連續相變萃取技術提取藍圓鲹魚油后萃取殘渣的基本成分和蛋白質內部結構變化,并利用堿性蛋白酶酶解制備藍圓鲹抗氧化肽。紅外光譜圖結果顯示,藍圓鲹魚粉在脫脂后,其蛋白質二級結構中的剛性結構與柔性結構與未脫脂相比變化不大,且使得蛋白質內部結構趨于穩定的狀態;而圓二色的結果進一步表明,脫脂藍圓鲹魚粉中的蛋白質內部的α-螺旋、β-轉角、β-折疊及無規卷曲含量并未發生明顯變化,因此也驗證了該提取技術對藍圓鲹蛋白的二級結構并沒有影響。采用堿性蛋白酶對脫脂藍圓鲹魚粉進行酶解制備抗氧化肽,通過正交試驗優化,得到最佳酶解工藝條件:料液比為1∶25 (w/v),酶解溫度為50 ℃,加酶量為8000 U/g·pro時,在此條件下酶解物的DPPH自由基清除率最高,達到89.99%±0.13%。由此可知,利用低溫連續相變技術提取藍圓鲹魚油后,其萃取殘渣的蛋白質結構與活性沒被破壞,使殘渣得到綜合利用,提高藍圓鲹的加工價值,為進一步研究藍圓鲹蛋白的結構與其生物活性功能奠定了基礎。