雙酶水解螺旋藻藻膽蛋白制備ACE抑制肽的工藝優化

馬 瑩,胡志和,2,薛 璐,2,*,潘 穎,周寶宏,賈蘊琴,王麗娟,2,吳子健,2

(1.天津商業大學生物技術與食品科學學院,天津 300134; 2.天津市食品生物技術重點實驗室,天津 300134)

血管緊張素轉化酶(Angiotensin-Converting Enzyme,ACE)是一種羧二肽酶,能使血管緊張素Ⅰ轉變成血管緊張素Ⅱ,血管緊張素Ⅱ具有血管收縮調節功能,同時ACE能水解緩激肽,使之失去活性,使人體血壓升高[1-2]。ACE抑制肽是一類從食物中提取的具有降血壓的活性多肽[3]。ACE抑制劑的研究與開發對治療高血壓意義重大[4]。

2015年我國高血壓患者超過3億人,預防和治療高血壓已經成為了全世界醫學領域的一項重要任務。治療高血壓的化學合成藥物有卡托普利、阿拉普利等。但這些藥物會產生一定的副作用,如咳嗽、味覺紊亂、皮疹、不能停止服藥等,在治療高血壓方面就會受到一定的限制[5-6]。因此尋求更高效更安全的降壓藥物變得尤其重要。從食源蛋白質中得到的降血壓肽既能使動物體血壓適當降低[7-8],又能保證其安全性,同時對血壓正常的動物體沒有降壓作用,彌補了常見降壓藥物使血壓過度下降易誘發心臟病突發提高死亡率的不足[9]。1965年Ferreira[10]首次從南美洲蝮蛇(Bothropsjararaca)的毒液中發現血管緊張素轉化酶抑制劑。1971年Ondetti等[11]從蝮蛇中分離出1個九肽片段,并經過體內外實驗表明具有抗高血壓作用。后來人們陸續從各種食物蛋白中發現分離出多種ACE抑制肽,諸如乳及乳制品[12-14]、發酵食品[15-16]、植物[17-19]、水產品[20-21]、明膠[22]、海洋藻類[23]等。本課題組胡志和等[24]利用胃蛋白酶和胰蛋白酶對牛乳酪蛋白進行水解,再通過超濾和Sephadex G-15凝膠色譜法將水解產物純化,最終確定了一種新的ACE抑制肽YQKFPQYLQY。Lu等[25]通過實驗證實,自發性高血壓大鼠灌胃YQKFPQYLQY后,其收縮壓顯著降低。

螺旋藻營養價值很高,優質蛋白質、螺旋藻多糖、人體必需微量元素以及多種維生素都是螺旋藻的重要組成成分。其蛋白質含量高達60%～70%,是自然界中具有重大開發價值的食用和餌料蛋白資源,被形象的稱為“超級微型營養庫”。由于其細胞壁中幾乎不含纖維素,故人體消化吸收十分容易,經過實驗測定螺旋藻的消化吸收率在90%以上,并且蛋白的消化率達75%,在當今的社會中,蛋白質的資源嚴重不足,螺旋藻是一種純天然品質優良的蛋白質。

目前制備ACE抑制肽多為單一蛋白酶水解,很少模擬胃腸道系統的酶解過程。而經其他酶水解得到的ACE抑制肽在人體消化吸收過程中,由于胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用,其氨基酸序列有可能會發生變化,進而導致ACE抑制能力的變化。因此,本研究在課題組前期研究工作的基礎上,以螺旋藻藻膽蛋白為原料,采用胃蛋白酶、胰蛋白酶先后對螺旋藻藻膽蛋白進行水解來制備ACE抑制肽。通過雙酶組合酶解產物在模擬胃腸道消化系統中的效果,得到有消化穩定性的ACE 抑制肽。為今后抗高血壓類功能性食品研發提供新原料,并為ACE抑制肽的構效關系研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鈍頂螺旋藻粉 內蒙怡健生物制品有限公司;胃蛋白酶(≥ 250 U/mg)、N-Hippuryl-His-Leu hydrate(HHL)、血管緊張素轉化酶(ACE)、馬尿酰組胺酰亮氨酸(hippuryl-histidyl-leucine,HHL)、胰蛋白酶(≥250 U/mg) 美國Sigma公司;十二烷基硫酸鈉(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、丙烯酰胺、N,N-亞甲叉雙丙烯酰胺 美國Bio-Rad公司;甘氨酸 中國醫藥集團上海化學試劑公司;Tris-堿 德國Roche公司;無水甲醇、無水乙醇、福林酚等 均為國產分析純。

MODUL YOD-230型冷凍干燥機 Thermo公司;UV-2100型分光光度計 Unico公司;FA1104N電子天平 上海精密科學儀器有限公司;KDC-160HR型高速冷凍離心機 科大創新股份有限公司中佳分公司;Amicon Ultra-10kDa超濾離心管、Amicon Ultra-3kDa Millipore超濾離心管 上海必泰生物科技有限公司;HL-2型恒流泵 上海滬西分析儀器廠;;電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 反復凍融法和超聲波解凍結合法提取藻膽蛋白 準確稱取螺旋藻粉400 g,溶于10 L的去離子水中,即料液比為1∶25 (m/v)之后將螺旋藻溶液均勻的分到6個2 L溶劑瓶中,在-80 ℃的冰箱中進行冷凍,待螺旋藻溶液充分冷凍后取出放置于40 ℃的水浴槽中,將超聲功率固定在650 W,進行超聲波輔助解凍。瓶子編號分別是1、2、3、4、5、6,編號1的凍融一次,編號2的凍融兩次,依次類推,在每解凍后取500 mL解凍液進行離心,取離心的上清液,之后進行螺旋藻粉藻膽蛋白含量的測定,蛋白質含量測定采用凱氏定氮法[27],計算蛋白質溶出率。

蛋白質溶出率(%)=上清液蛋白質含量×100/螺旋藻粉中蛋白質含量

1.2.2 等電點法分離蛋白 根據1.2.1反復凍融法和超聲波解凍結合法提取藻膽蛋白,收集凍融5次條件下螺旋藻粉解凍液的上清液6000 mL,上清液均勻地分裝到6個燒杯中,將0.1 mol/L濃度的稀鹽酸加入上清液中,邊滴加邊攪拌混勻,分別調節pH至3.50、3.75、4.00、4.25、4.50、4.75,靜置2 h后,溫度控制在10 ℃,以4000 r/min離心20 min,收集蛋白沉淀冷凍干燥得到粗蛋白粉末,稱量得到的粗蛋白粉末的重量。用分光光度計測量650 nm處殘余蛋白的吸光度值。吸光度值越低證明蛋白質沉淀效果越好。

1.2.3 采用SDS-PAGE凝膠電泳法分析提取蛋白的種類 根據所測蛋白質的帶電密度及所分離蛋白樣品的相對分子質量大小來設計不同濃度的膠,通過預實驗得出分離膠及濃縮膠配方如表1。

表1 分離膠及濃縮膠配方Table 1 Separation and concentrate formulas

1.2.4 胃蛋白酶水解藻膽蛋白

1.2.4.1 水解工藝 稱取一定量的螺旋藻藻膽蛋白,以蒸餾水配成一定濃度溶液,水浴攪拌,待溫度達到所需溫度后,調節pH,按一定的酶底比加入胃蛋白酶,開始水解。在攪拌狀態下,不斷加入濃度為1 mol/L的HCl,以使pH始終維持在試驗規定范圍內。水解結束后,沸水浴滅酶15 min。冷卻后以轉速6000 r/min離心30 min,取上清液冷凍干燥,-80 ℃貯藏,備用。

1.2.4.2 溫度對胃蛋白酶水解藻膽蛋白 ACE 抑制率的影響 在酶與底物比為2610 U/g,底物質量分數為6%的條件下,水解溫度分別控制在27、32、37、42、47 ℃,并分別測定藻膽蛋白的ACE抑制率。

1.2.4.3 酶與底物比對胃蛋白酶水解藻膽蛋白ACE抑制率的影響 在溫度為37 ℃,底物質量分數為6%的條件下,酶與底物比分別控制在1044、1305、1740、2610、5220 U/g,并分別測定藻膽蛋白的ACE抑制率。

1.2.4.4 底物質量分數對胃蛋白酶水解藻膽蛋白ACE抑制率的影響 在溫度為37 ℃,酶與底物比為2610 U/g的條件下,底物質量分數分別控制在2%、4%、6%、8%、10%,并分別測定藻膽蛋白的ACE抑制率。

1.2.5 胃蛋白酶水解正交試驗 根據單因素實驗的結果,選擇測得的ACE抑制率最高的試樣,將所得的底物濃度、酶與底物比、水解溫度值前后選擇兩個數值,以底物濃度、酶與底物比、水解溫度為影響因素,以ACE抑制率為考察指標,進行L9(34)正交實驗,因素水平見表2。將9組實驗組按照1.2.4.1方法操作,所得干燥粉于-80 ℃條件下貯藏備用。

表2 胃蛋白酶水解藻膽蛋白正交實驗因素水平表Table 2 Factors and levels pepsin hydrolysis spirulina phycobiliprotein orthogonal experiment

1.2.6 胰蛋白酶水解單因素實驗

1.2.6.1 水解工藝 稱取一定量的經胃蛋白酶水解后螺旋藻藻膽蛋白,以蒸餾水配成一定濃度溶液,水浴攪拌,待溫度達到所需溫度后,調節pH,按一定的酶底比加入胰蛋白酶,開始水解。在攪拌狀態下,不斷加入濃度為1 mol/L的NaOH,以使pH始終維持在試驗規定范圍內。水解結束后,沸水浴滅酶15 min。冷卻后以轉速6000 r/min離心30 min,取上清液冷凍干燥,-80 ℃貯藏,備用。

1.2.6.2 溫度對胰蛋白酶水解藻膽蛋白 ACE 抑制率的影響 在酶與底物比為2610 U/g,底物質量分數為6%的條件下,水解溫度分別控制在37、40、42、45、48、50 ℃,并分別測定藻膽蛋白的ACE抑制率。

1.2.6.3 酶與底物比對胰蛋白酶水解藻膽蛋白ACE抑制率的影響 在溫度為42 ℃,底物質量分數為6%的條件下,酶與底物比分別控制在1044、1305、1740、2610、5220、13050 U/g并分別測定藻膽蛋白的ACE抑制率。

1.2.6.4 底物質量分數對胰蛋白酶水解藻膽蛋白ACE抑制率的影響 在溫度為42 ℃,酶與底物比為2610 U/g的條件下,底物質量分數分別控制在2%、3%、4%、5%、6%、7%,并分別測定藻膽蛋白的ACE抑制率。

1.2.7 胰蛋白酶水解正交試驗 根據單因素實驗的結果,選擇測得的ACE抑制率最高的試樣,將所得的底物濃度、酶與底物比、水解溫度值前后選擇兩個數值,以底物濃度、酶與底物比、水解溫度為影響因素,以ACE抑制率為考察指標,進行L9(34)正交實驗,因素水平見表3。將9組實驗組按照1.2.6.1方法操作,所得干燥粉于-80 ℃條件下貯藏備用。

表3 胰蛋白酶水解螺旋藻藻膽蛋白正交試驗因素水平表Table 3 Factors and levels trypsin hydrolysis spirulina phycobiliprotein orthogonal test

1.2.8 水解液的超濾 將最優條件下水解的水解液先用截留分子質量10 kDa超濾離心管進行超濾,超濾液再用截留分子質量為3 kDa的超濾膜進行超濾,最后分別將分子質量大于10 kDa、小于10 kDa且大于3 kDa和小于3 kDa的超濾液分別冷凍干燥后配成1 mg/mL的濃度進行ACE抑制活性的檢測。

1.2.9 ACE抑制肽體外活性檢測方法 采用紫外分光光度法測定乳清蛋白水解ACE抑制肽的體外活性,具體實驗條件如下表4所示。

表4 ACE抑制率體外檢測方法Table 4 The detection method of ACE inhibition ratio in vitro

按表4所示,將所有試劑依次加入到5 mL離心管中振蕩混和均勻,待反應結束后加入1.7 mL乙酸乙酯(4 ℃),旋渦振蕩20 s,萃取反應中產生的馬尿酸,混勻后放入于4 ℃下預冷過的離心機離心(4000 r/min,15 min,4 ℃),吸取1.0 mL乙酸乙酯上層液至玻璃試管中,在120 ℃的恒溫烘箱中烘干30 min,取出待試管冷卻后加入3 mL超純水溶解,旋渦振蕩20 s,用紫外分光光度計測定復溶液在228 nm處的吸光度,每組實驗做三個平行,具體計算公式如下:

式中:A代表反應體系中加入ACE抑制劑時的吸光度;B代表反應體系中僅有ACE與HHL反應時的吸光度,即對照;C代表空白反應的吸光度,即空白。

1.3 數據處理

用origin 8.5和Excel進行圖表處理。

2 結果與討論

2.1 螺旋藻粉蛋白中含量測定

通過凱氏定氮法測得螺旋藻粉中粗蛋白質的含量為65%±2.6%,為后續的藻膽蛋白的提取和分離提供基礎。

2.2 反復凍融法和超聲波解凍結合法提取螺旋藻藻膽蛋白

由圖1可知,反復凍融5次的粗蛋白的溶出率為最高,為64.87%,5次之后粗蛋白的溶出率并沒有再提高,并且有下降的趨勢。

圖1 不同凍融次數螺旋藻藻膽蛋白溶出率Fig.1 Dissolution rate of spirulina protein with different freezing and thawing times

2.3 等電點法分離蛋白

通過圖2可知,pH由3.50到4.75,粗蛋白的提取量的趨勢為是先增長后減少,其中最低為9.26 g。其中當pH為4.25時提取量達到最高,達到14.36 g。圖3中,當pH逐漸增大,所測得上清液蛋白的吸光度值的趨勢則恰恰相反,先減小又增大,并且在pH為4.25時,所測得吸光度值為最低,為1.306,證明此時蛋白沉淀效果最好。故綜合以上圖示可知,當pH為4.25時等電點沉淀的效果為最好。

圖2 不同pH下粗蛋白提取量Fig.2 Crude protein extraction at different pH values

圖3 不同pH下上清液吸光度值測定Fig.3 Determination of absorbance of supernatant at different pH

2.4 SDS-PAGE凝膠電泳法分析提取蛋白的種類

螺旋藻藻膽蛋白分為2大類,分別是藻藍蛋白、藻和別藻藍蛋白。由圖4可以看出四種分子量的蛋白質,分別為110、49、24和18 kDa。Qin等[28]發現β-APC(別藻藍蛋白β亞基)的分子量為18 kDa,所以圖4集中在18 kDa的條帶應該是β-APC。其他三種分子量的蛋白猜測是不同種類的藻藍蛋白。

圖4 SDS-PAGE凝膠電泳圖Fig.4 SDS-PAGE gel electrophoresis注:泳道1為濃度0.5 mg/mL藻膽蛋白,泳道2為標準蛋白。

2.5 胃蛋白酶水解螺旋藻藻膽蛋白單因素實驗

2.5.1 底物質量分數對水解產物ACE抑制率的影響 由圖5可知,隨著底物質量分數的升高,水解產物ACE抑制率也在升高,當底物質量分數達到6%時,ACE抑制率達到最高,為85.27%,之后隨著底物質量分數的升高,ACE抑制率下降。因此最佳底物濃度條件為6%。

圖5 不同底物質量分數條件下水解產物的ACE抑制率Fig.5 ACE inhibition rate of hydrolysate under different substrate mass fractions

2.5.2 酶與底物比對水解產物ACE抑制率的影響 由圖6可見,隨著酶與底物之比的升高,水解產物ACE抑制率也在升高,當酶底比達到2610 U/g時,ACE抑制率達到最高,之后隨著底物濃度的升高,ACE抑制率逐漸下降。所以當酶底比達到2610 U/g時,水解產物的抑制率最高,為83.33%。即最佳酶底比為2610 U/g。

圖6 不同酶底比條件下水解產物的ACE抑制率Fig.6 ACE inhibition rate of hydrolysate under different enzyme bottom ratio conditions

2.5.3 水解溫度對水解產物ACE抑制率的影響 由圖7可見,隨著水解溫度的升高,水解產物ACE抑制率先維持穩定,當水解溫度達到37 ℃時,抑制率達到最高,為83.33%,之后隨著水解溫度的升高,抑制率逐漸下降,因此最佳水解溫度為37 ℃。

圖7 不同水解溫度條件下水解產物的ACE抑制率Fig.7 ACE inhibition rate of hydrolysate under different hydrolysis temperature conditions

2.6 胃蛋白酶水解螺旋藻藻膽蛋白正交實驗條件

由表5可以看出,水解溫度、酶底比、底物質量分數這三個不同的因素對ACE抑制率的大小都會產生一定的影響,結果影響大小排列是A>B>C,分別代表水解溫度>酶和底物比值>底物質量分數,通過K值越大,實驗方案可能越優的原則,選擇兩組A2B1C1和A2B1C3進行實驗,A2B1C1組合條件下得到的ACE抑制率為80.26%,A2B1C3條件下得到的ACE抑制率為76.27%,與方案A2B1C2條件下得到的ACE抑制率進行對比,結果顯示A2B1C2的條件下的ACE抑制率最高,所以最好的實驗方案為A2、B1、C2,即水解溫度是 37 ℃,底物質量分數6%,酶和底物的比值是5220 U/g,在這個條件下得到的ACE抑制率為82.07%。

2.7 胰蛋白酶水解藻膽蛋白的單因素試驗

2.7.1 底物質量分數對水解產物的ACE抑制率的影響 由8可知,隨著底物質量分數的升高,水解產物ACE抑制率也在升高,當底物質量分數達到6%時,ACE抑制率達到最高,為68.42%,之后隨著底物質量分數的升高,ACE抑制率下降。因此最佳底物濃度條件為6%。

圖8 不同底物質量分數的酶解產物對ACE抑制活性的影響Fig.8 Effect of ACE inhibitory activity by enzymatic hydrolysates of different substrate mass fractions

2.7.2 酶與底物比對水解產物的ACE抑制率的影響 由圖9可見,隨著酶與底物之比的升高,水解產物ACE抑制率也在升高,當酶底比達到2610 U/g時,ACE抑制率達到最高,之后隨著底物濃度的升高,ACE抑制率維持平穩后下降。所以當酶底比達到2610 U/g時,水解產物的抑制率最高,為68.42%。即最佳酶底比為2610 U/g。

圖9 不同酶與底物比的酶解產物對ACE抑制活性的影響Fig.9 Effect of ACE inhibitory activity of enzymatic hydrolysates of different enzymes to substrates

2.7.3 溫度對水解產物ACE抑制率的影響 由圖10可見,隨著水解溫度的升高,水解產物ACE抑制率逐漸升高,當水解溫度達到42 ℃時,抑制率達到最高,之后隨著水解溫度的升高,抑制率逐漸下降。所以當水解溫度達到42 ℃時,水解產物的抑制率最高,為68.42%。即最佳水解溫度為42 ℃。

圖10 不同酶解溫度的酶解產物對ACE抑制活性的影響Fig.10 Effect of ACE inhibitory activity of enzymatic hydrolysate at different enzymatic temperatures

2.8 胰蛋白酶水解藻膽蛋白螺旋藻正交試驗

由表6可以看出,水解溫度,酶底比,底物質量分數這三個不同的因素對ACE抑制率的大小都會產生一定的影響。結果影響大小排列是A>B>C,分別代表水解溫度>酶和底物比值>底物質量分數,通過K值越大,實驗方案可能越優的原則,也可以得到A2B1C2組合下實驗方案最好,即水解溫度是42 ℃,底物質量分數6%,酶和底物的比值是5220 U/g,pH為8.0時,在這個條件下得到的ACE抑制率為80.35%。

表6 胰蛋白酶水解螺旋藻藻膽蛋白正交試驗結果與分析Table 6 Results and analysis of orthogonal test of trypsin hydrolyzed spirulina phycobiliprotein

2.9 螺旋藻藻膽蛋白ACE抑制肽的超濾分離

螺旋藻藻膽蛋白酶解液經超濾分離得到3個組分,它們的ACE抑制活性如圖11所示。A3組分的ACE抑制率高于其他組分,其中,A3組分的ACE抑制率為94.30%。

圖11 酶解物不同組分的ACE抑制活性Fig.11 ACE inhibitory activity of different molecular mass hydrolysates注:A1:>10 kDa、A2:3～10 kDa和A3:<3 kDa。

3 結論

本研究以螺旋藻為原料,首先通過反復凍融法和超聲波解凍結合法提取螺旋藻藻膽蛋白,反復凍融5次最佳,在反復凍融之后運用等電點沉淀法沉淀粗蛋白,經過pH梯度實驗,確定了最佳沉淀pH為4.25。再通過單因素實驗以及正交實驗證明,利用胃蛋白酶水解螺旋藻藻膽蛋白制備有活性的ACE抑制肽時,當水解溫度為37 ℃,酶與底物比為5220 U/g,底物濃度為6%時,胃蛋白酶水解螺旋藻藻膽蛋白制備所得的ACE抑制肽對ACE的抑制率最高,ACE抑制率為82.07%。利用胰蛋白酶水解螺旋藻藻膽蛋白制備有活性的ACE抑制肽時,當水解溫度是 42 ℃,底物質量分數6%,酶和底物的比值是5220 U/g時,胰蛋白酶水解螺旋藻藻膽蛋白制備所得的ACE抑制肽對ACE的抑制率最高,ACE抑制率為80.35%。經過超濾得到分子量小于3 kDa的藻膽蛋白酶解液,ACE抑制率為94.30%。具有較高的活性。另一方面,本研究利用胃蛋白酶和胰蛋白酶雙酶進行酶解,可以側面反映ACE抑制肽進入人體后,不會因為人體內的胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解導致ACE抑制率發生大幅變化。研究結果有助于深入研究螺旋藻藻膽蛋白在消化道內的消化代謝過程,并為藻膽蛋白ACE抑制肽的開發提供理論基礎。