石榴籽多糖硒酸酯合成工藝優化及其抗油脂氧化能力

王占一,李卓瓦,畢海丹,王 飛,王京龍,向 蘭

(1.棗莊學院食品科學與制藥工程學院,山東棗莊 277160; 2.山東大學藥學院,山東濟南 250012)

人體所含的微量元素中,硒是必不可少的,能夠提高人體非特異性免疫能力、能夠預防惡性腫瘤、溶血性貧血、克山病等多種疾病[1]。生物利用度較高的有機硒通常以硒多糖、硒蛋白和硒核酸等形式存在,其中硒多糖,即元素硒與多糖的合成產物,是理想的補硒產品,在人體內能發揮元素硒與多糖雙重生理活性[2-3]。然而,自然界中的富硒多糖含量極少,富硒栽培所得的硒多糖,存在硒含量不高等不足,難以得到理想的硒多糖。因此,國內外學者致力于富硒多糖的制備及生物活性方面的研究[4]。張繼等[5]采用正交試驗設計法將蘭州百合多糖制備成多糖硒酸酯,通過拉曼光譜和熱重分析等鑒定發現,硒在合成產物中以Se=O鍵形式存在;顏炳祥等[6]研究發現,硒化后的乳酸菌胞外多糖對羥基自由基的清除能力顯著增強;李華為等[7]研究發現,蛹蟲草硒化多糖對羥基自由基的清除效果好于過氧化氫酶。

石榴(PunicagranatumL.)是亞熱帶地區常見樹種,全球各地區均有廣泛分布[8]。果實成熟后的種子,即石榴籽是石榴果品的主要副產品之一,近年來,關于石榴籽中生物活性成分的研究報道較多,郭傳琦等[9]采用正交試驗設計法對石榴籽中多糖提取工藝條件進行優化,發現石榴籽中多糖成分含量較高;楊麗娜等[10]和張立華等[11]研究證實,石榴籽提取物中多糖及多酚類成分,具有較強的清除自由基能力,對四氯化碳誘導小鼠肝損傷保護作用效果明顯。但是,關于石榴籽多糖硒酸酯合成工藝優化、產物結構分析和抗氧化等方面的研究,國內尚未見報道。

鑒于此,本課題組在前期實驗中[12],以果膠酶、纖維素酶和甘露聚糖酶作為復合酶組成,采用復合酶解法提取,并經過后期純化得到純度較高的石榴籽多糖成分。本實驗以石榴籽多糖和亞硒酸鈉為合成原料,稀硝酸和氯化鋇為催化劑,采用Box-Behnken試驗設計法優化了石榴籽多糖硒酸酯的合成工藝條件,并對合成產物結構和抗油脂氧化能力進行研究,以期為石榴籽多糖硒酸酯的工業化生產及開發利用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴籽多糖 多次純化得均一多糖,棗莊學院生物學省級實驗教學示范中心提供;硒粉標準品 純度>99.99%,上海博頓生物化工有限公司;天然大豆油 市售;豬油 自制;硝酸、亞硒酸鈉、抗壞血酸、無水乙醇、丙酮、鹽酸、氨水、氯化銨、氯化鋇、鄰苯二胺鹽酸鹽、甲苯、高氯酸、硫酸鈉、三氯甲烷、冰乙酸、碘化鉀、溴化鉀、硫代硫酸鈉、淀粉指示劑、吐溫-60、硫酸 天津市東麗區天大化學試劑廠;蒸餾水 棗莊學院生物學省級教學示范中心提供。

VERTEX-80V型真空傅里葉變換紅外光譜儀 德國BRUKER公司;STA409PC型同步熱分析儀 德國耐馳儀器制造有限公司;UV-4802S型紫外-可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;LGJ-18A型冷凍干燥機 上海比朗儀器制造有限公司;FA1104B型電子分析天平 上海越平科學儀器有限公司;HH-4型電熱恒溫水浴鍋 上海谷寧儀器有限公司;HTP201C型恒溫恒濕試驗箱 北京環創科學儀器有限公司;8000 dol透析袋 上海創賽科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.2 石榴籽多糖硒酸酯中硒含量的測定

1.2.2.1 標準曲線的制作 將硒粉標準品于105 ℃恒溫干燥至恒重,精密稱取25.00 mg置于50 mL燒杯中,用適量HNO3消化至溶液澄清后,轉移至25 mL容量瓶中,以重蒸餾水定容,作為備用液。精密量取備用液2.0 mL,用重蒸餾水定容至500 mL,即為硒對照品溶液(濃度為4 μg/mL)。取硒對照品溶液0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL,分別置于50 mL小燒杯中,加重蒸餾水25 mL,用0.5% HCl調pH=2,再加入2%鄰苯二胺鹽酸鹽溶液1.0 mL,充分攪拌,靜置2 h,轉移至100 mL分液漏斗中,用甲苯萃取2次,每次10 mL,分取甲苯層,轉移至25 mL容量瓶中,并用甲苯定容至刻度。以不加硒對照品的溶液作對照,在334 nm波長下測定吸光值(A值),并以A值為縱坐標,系列濃度(C值)為橫坐標制作標準曲線,求得回歸方程為:A=0.2025C+0.0839,相關系數r=0.9993,硒含量在0～1.96 μg/mL范圍內與A值呈良好線性關系[16-17]。

1.2.2.2 樣品硒含量的測定 精密稱取石榴籽多糖硒酸酯及未修飾的石榴籽多糖各20 mg,分別置于50 mL小燒杯中,加入混酸(HClO4∶H2SO4∶HNO3=1∶1∶4)3 mL消化至液體無色后,將小燒杯置于95 ℃水浴鍋中恒溫加熱2 h,冷卻至室溫后,加重蒸餾水25 mL,按照1.2.2.1項下方法處理后測定A值,計算石榴籽多糖硒酸酯產物硒含量及收率[16-17]。

式中:m1為石榴籽多糖硒酸酯的質量,mg;m2為石榴籽多糖的質量,mg。

1.2.3 單因素實驗設計

1.2.3.1 原料配比對產物硒含量及收率的影響 改變石榴籽多糖和Na2SeO3的質量比,使其分別為1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1.0、1∶1.2、1∶1.4,反應時間8 h,硝酸濃度為0.6%,反應溫度75 ℃,按1.2.1項下方法合成多糖硒酸酯,以產物硒含量及收率為指標,考察原料配比對產物硒含量及收率的影響。

1.2.3.2 反應溫度對產物硒含量及收率的影響 改變反應溫度,使其分別為45、55、65、75、85、95 ℃,原料配比1∶1.0,硝酸濃度為0.6%,加熱時間8 h,按1.2.1項下方法合成多糖硒酸酯,以產物硒含量及收率為指標,考察反應溫度對產物硒含量及收率的影響。

1.2.3.3 硝酸濃度對產物硒含量及收率的影響 改變硝酸濃度,使其分別為0.30%、0.45%、0.60%、0.75%、0.90%、1.05%,原料配比1∶1.0,反應溫度75 ℃,加熱時間8 h,按1.2.1項下方法合成多糖硒酸酯,以產物硒含量及收率為指標,考察硝酸濃度對產物硒含量及收率的影響。

1.2.3.4 反應時間對產物硒含量及收率的影響 改變反應時間,使其分別為2、4、6、8、10、12 h,原料配比1∶1.0,反應溫度 75 ℃,硝酸濃度為0.6%,按1.2.1項下方法合成多糖硒酸酯,以產物硒含量及收率為指標,考察反應時間對產物硒含量及收率的影響。

1.2.4 Box-Behnken試驗優化設計 在單因素實驗的基礎上,應用Box-Behnken試驗設計,以原料配比、反應溫度、硝酸濃度和反應時間為自變量,以石榴籽多糖硒酸酯產物硒含量和產物收率為響應值優化合成工藝條件[18-19],因素水平表見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Level and factors table of response surface experiment

1.2.5 石榴籽多糖硒酸酯的結構分析

1.2.5.1 紫外光譜分析 稱取石榴籽多糖硒酸酯及未修飾的石榴籽多糖各20 mg,分別置于50 mL小燒杯中,加入混酸(HClO4∶H2SO4∶HNO3=1∶1∶4)3 mL消化至液體無色后,將小燒杯置于95 ℃水浴鍋中恒溫加熱2 h,冷卻至室溫,加重蒸餾水25 mL,按照1.2.2.1項下方法處理后,應用紫外-可見分光光度計,在300～400 nm波長范圍內進行紫外掃描,分析合成產物的特征基團[5,15]。

1.2.5.2 紅外光譜分析 稱取石榴籽多糖硒酸酯及未修飾的石榴籽多糖各10 mg,加入干燥的KBr,攪拌均勻,在瑪瑙研缽中研磨壓片,應用真空型傅里葉變換紅外光譜儀在400～4000 cm-1范圍內進行紅外掃描,分析合成產物的特征基團[14-16]。

1.2.5.3 差熱分析 稱取石榴籽多糖硒酸酯及未修飾的石榴籽多糖各10 mg,適當處理后,應用同步熱分析儀進行熱重掃描,比較二者結構穩定性的變化。升溫速率10 ℃/min,升溫范圍25～700 ℃,氣氛為靜態氮氣,參比物為Al2O3[5,14-15]。

1.2.6 石榴籽多糖硒酸酯的抗油脂氧化能力試驗

1.2.6.1 石榴籽多糖硒酸酯對植物油脂的抗氧化試驗 精密稱取石榴籽多糖硒酸酯0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg,蒸餾水1.5 mg(空白對照)和抗壞血酸1.5 mg(陽性對照)分別置于100 mL小燒杯中,依次加入5.0 mL重蒸餾水和0.5 g吐溫-60,50 mL大豆油,攪拌均勻后,放入(60±1) ℃恒溫恒濕試驗箱中保存,分別在0、2、4、6、8、10、12、14、16 d取樣1.5～2 g測定其過氧化值(POV,mmol/kg),比較不同加入量的石榴籽多糖硒酸酯對植物油脂的抗氧化作用[11,20-21]。

1.2.6.2 石榴籽多糖硒酸酯對動物油脂的抗氧化試驗 精密稱取石榴籽多糖硒酸酯0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg,蒸餾水1.5 mg(空白對照)和VC1.5 mg(陽性對照)分別置于100 mL小燒杯中,依次加入5.0 mL重蒸餾水、0.5 g吐溫-60、40 g豬油,攪拌均勻后,放入(60±1) ℃恒溫恒濕試驗箱中保存,分別在0、2、4、6、8、10、12、14、16 d取樣1.5～2 g測定POV值,比較不同加入量的石榴籽多糖硒酸酯對動物油脂的抗氧化作用[11,20-21]。

1.2.6.3 抗油脂氧化能力評價 準確稱取1.2.5.1和1.2.5.2項下所取試樣1.5～2 g于250 mL錐形瓶中,加入三氯甲烷-冰乙酸(體積比為1∶1)混合溶液30 mL,飽和KI溶液1 mL,封口,搖勻后置于暗處5 min,加入蒸餾水100 mL,搖勻后立即用0.002 mol/L Na2S2O3標準溶液滴定,待溶液呈現淡黃色時,加入淀粉指示劑1 mL,繼續滴定至藍色消失為止,計算POV數值[11,20,22-23]。

式中:V1為試樣消耗Na2S2O3標準液體積,mL;V0為空白對照試樣消耗Na2S2O3標準液體積,mL;C為Na2S2O3標準液的濃度,mol/L;m為試樣的質量,g。

1.3 數據處理

Box-Behnken設計采用Design-Expert 8.0.5統計分析軟件,圖形制作采用Excel和Origin Pro 8.0數據處理軟件。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

圖1 原料配比對合成產物硒含量及收率的影響Fig.1 Effects of raw material ratio on contents and yields of Se

2.1.2 反應溫度對產物硒含量及收率的影響 圖2為反應溫度對合成產物硒含量及收率的影響。由圖2可知,隨著反應溫度的提高,產物硒含量及收率呈現先上升后下降趨勢,當溫度超過75 ℃時,隨著反應溫度的提高,產物硒含量及收率呈現下降趨勢,原因可能是該合成反應是一個吸熱過程,溫度較低時,不利于反應的進行,溫度較高時,多糖的羥基被加速氧化,糖苷鍵裂解也將加快,因而嚴重影響了有機硒的穩定性。因此,反應溫度應該控制在75 ℃。

圖2 反應溫度對合成產物硒含量及收率的影響Fig.2 Effects of reaction temperature on contents and yields of Se

2.1.3 硝酸濃度對產物硒含量及收率的影響 圖3為硝酸濃度對合成產物硒含量及收率的影響。由圖3可知,硝酸作為合成反應的催化劑,其濃度對產物硒含量及收率的影響很大,隨著硝酸濃度的增大,二者均呈現先升高后降低的趨勢。當硝酸濃度為0.60%時,二者均達到最大值,當硝酸濃度超過0.75%時,產物硒含量及收率下降明顯,原因可能是硝酸具有強氧化性,其濃度較低時,催化效果不明顯,濃度較高時,多糖的羥基被氧化或糖苷鍵裂解,破壞了合成產物的穩定性。因此,硝酸濃度應控制在0.60%左右。

圖3 硝酸濃度對合成產物硒含量及收率的影響Fig.3 Effects of concentration of HNO3on contents and yields of Se

2.1.4 反應時間對產物硒含量及收率的影響 圖4為反應時間對合成產物硒含量及收率的影響。由圖4可知,隨著硝酸濃度的增大,硒含量及收率均呈現先升高后降低的趨勢。反應時間2～8 h時,合成反應時間越長,產物硒含量及收率越高,但是當反應時間超過8 h時,產物硒含量及收率不再升高,反而呈現減少趨勢,原因可能是,反應時間延長,促進了多糖的降解,嚴重影響了有機硒的穩定性。因此,反應時間應該控制在8 h左右。

圖4 反應時間對合成產物硒含量及收率的影響Fig.4 Effects of reaction time on contents and yields of Se

2.2 響應面試驗結果

綜合單因素實驗結果,采用Box-Behnken試驗設計方法,將原料配比、反應溫度、硝酸濃度和反應時間依次編碼為X1、X2、X3、X4作為自變量,其編碼值1、0、-1分別代表自變量的高、中低水平,以合成產物硒含量(Y1)和收率(Y2)作為響應值,應用Design-Expert 8.0.5統計分析軟件建立回歸數學模型,Box-Behnken試驗設計及結果見表2。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface test

通過對表2中的數據進行回歸擬合,得到合成產物硒含量(Y1)和收率(Y2)的四元二次回歸方程如下:

式(1)

式(2)

方程式(1)顯著性檢驗與方差分析結果見表3。從方差分析結果可知,回歸模型的決定系數R2=0.9078,p<0.0001,模型極顯著,說明模型能夠反映響應值的變化,回歸方程適用于合成產物硒含量的理論預測。失擬項p=0.0661,影響不顯著,說明殘差是由隨機誤差引起?；貧w方程的一次項X1、X2、X4,交互項X3X4對產物硒含量的影響均達到顯著水平(p<0.05),X3以及二次項X12、X42均達到極顯著水平(p<0.01),說明響應值的變化相當復雜,試驗因素對產物硒含量的影響并不是簡單的線性關系[18-19]。

表3 產物硒含量回歸方程的方差分析結果Table 3 Variance analysis of regression equation for contents of Se

方程式(2)顯著性檢驗與方差分析結果見表4。從方差分析結果可知,回歸模型的決定系數R2=0.9105,p<0.0001,說明模型能夠反映響應值的變化,回歸方程適用于合成產物收率的理論預測。失擬項p=0.0583,影響不顯著,說明殘差具有隨機誤差引起。回歸方程的交互項X1X3對產物收率的影響達到顯著水平(p<0.05),一次項X4以及二次項X12、X22、X42均達到極顯著水平(p<0.01),同樣說明試驗因素對產物收率的影響并不是簡單的線性關系[19]。

表4 產物收率回歸方程的方差分析結果Table 4 Variance analysis of regression equation for product yield

經過Design-Expert 8.0.5統計軟件分析,得出制備石榴籽多糖硒酸酯的最佳工藝條件為:原料配比1∶1.02,反應溫度76.20 ℃,硝酸濃度0.74%,反應時間9.30 h,在此工藝條件下,合成產物硒含量的模型預測值為4.134 mg/g,產物收率的模型預測值為42.720%。實際操作中稍作調整,確定的最佳工藝條件為:原料配比1∶1.02,反應溫度76 ℃,硝酸濃度0.74%,反應時間9.3 h。在最佳工藝條件下進行5次平行試驗,測得合成產物硒含量為(4.117±0.02) mg/g,產物收率為42.596%±0.13%,偏差均小于0.5%,說明本工藝參數具有很好的穩定性[18]。

2.3 合成產物的結構分析

2.3.1 紫外光譜分析 圖5為石榴籽多糖(A)和合成產物(B)的紫外光譜。由圖5可以看出,合成產物(B)在波長334 nm處具有一個很強吸收峰,與文獻[24]報道硒元素在波長334 nm處所引起的吸收峰一致,而石榴籽多糖(A)在300～400 nm波長范圍內無吸收峰,證明了硒元素存在于合成產物的結構中[5,15]。

圖5 石榴籽多糖(A)和合成產物(B)的紫外光譜Fig.5 UV of polysaccharide of pomegranate seeds and synthetic product

2.3.2 紅外光譜分析 圖6中A為石榴籽多糖的紅外光譜圖,在3422.64 cm-1處出現O-H的伸縮振動峰;在1618.31 cm-1處出現強峰,為多糖結構中C=O的伸縮振動峰;在1141.52～1027.18 cm-1處出現吸收峰,為多糖結構中C-O的兩種伸縮振動峰。B為合成產物的紅外光譜圖,其吸收峰的波形、吸收強度和峰寬等指標與石榴籽多糖一致,說明合成產物的骨架結構并沒有發生改變,仍然具備石榴籽多糖的固有特征。不同的是,合成產物的紅外光譜圖在950.06、896.27、764.85 cm-1處出現了3個特征吸收峰,依次歸屬為合成產物結構中Se=O、C-Se和Se-O的伸縮振動峰,充分證明了硒元素存在于合成產物的結構中[14-16]。

圖6 石榴籽多糖(A)和合成產物(B)的紅外光譜Fig.6 IR of polysaccharide of pomegranate seeds and synthetic product

2.3.3 差熱分析 圖7a為石榴籽多糖及其合成產物的TG峰,將二者失重過程均分為4個階段,第1階段為失去吸附水階段,基本在100 ℃前結束,二者峰形大體相同;第2階段為緩慢失重階段,石榴籽多糖在100～245.5 ℃范圍內失重量為7.7%,而合成產物在此范圍內失重量為8.4%,二者的失重情況大體相同;第3階段為快速失重階段,石榴籽多糖在245.5～425.5 ℃范圍內出現快速失重現象,失重達到54.2%,而合成產物在此范圍內的失重率峰型更加陡峭,失重達到76.1%,說明合成產物的穩定性降低;第4階段為后失重階段,石榴籽多糖在425.5～600 ℃內失重為16.9%;而合成產物在此范圍內失重僅為4.5%,且在600 ℃前已經基本分解完全,說明合成產物的熱穩定性較差,原因可能是:石榴籽多糖硒酸酯分子中引入亞硝酸基,改變了石榴籽多糖固有的分子結構,亞硝酸基的存在使得產物在較高溫度下更容易脫水裂解,穩定性降低[5,14-15]。

圖7b為石榴籽多糖及其合成產物在氮氣環境中的熱勢圖,二者的失重過程均為放熱反應,均未體現出明顯的氧化過程,因此,二者的失重過程均為單一的熱裂解反應。

圖7 石榴籽多糖(A)和合成產物(B)的熱分析Fig.7 Thermogravimetric analysis of polysaccharide of pomegranate seeds and synthetic product

2.4 合成產物抗油脂氧化能力分析

2.4.1 合成產物抗植物油脂氧化能力分析 由圖8可知,植物油脂在(60±1) ℃高溫誘導后,發生了氧化反應,在烘箱中放置的時間越長,POV值越大,表明烘箱能夠使植物油脂自氧化反應加劇[20,25]。當添加合成產物后,5組不同添加量的油樣其POV值與空白對照組相比明顯下降,且隨著添加量的增加,抗植物油脂氧化能力增強,具有明顯的量效對應關系,且時間越長,效果越顯著,合成產物添加量達到2.0 mg的油樣,其抗氧化能力接近添加1.5 mg VC所達到的效果。

圖8 合成產物抗植物油脂氧化能力Fig.8 Antioxidant capacity of synthetic product against vegetable oil

2.4.2 合成產物抗動物油脂氧化能力分析 由圖9可知,動物油脂在(60±1) ℃高溫誘導后,同樣發生了氧化反應,時間越長,空白對照組的POV值越大,表明烘箱同樣能夠加快動物油脂的自氧化反應。動物油脂中添加合成產物后,其抗氧化活性比空白對照組明顯增強,5組不同添加量的油樣,均具有抗氧化效果,且隨著添加量的增加,抗動物油脂氧化能力增強,量效對應關系比較顯著。

圖9 合成產物抗動物油脂氧化能力Fig.9 Antioxidant capacity of synthetic product against animal oil

3 討論與結論

本試驗以石榴籽多糖和亞硒酸鈉為原料,稀硝酸和氯化鋇為催化劑,合成了石榴籽多糖硒酸酯,采用Box-Behnken試驗設計優化合成工藝參數為:原料配比1∶1.02,反應溫度76 ℃,硝酸濃度0.74%,反應時間9.3 h,該工藝條件下,測得合成產物硒含量為(4.117±0.02) mg/g,產物收率為42.596%±0.13%;合成產物經過紫外光譜、紅外光譜和熱重分析,充分證明了硒元素存在于石榴籽多糖硒酸酯的結構中。油脂抗氧化試驗結果表明,合成產物能夠明顯減緩植物油脂和動物油脂POV值升高趨勢,且具有一定的濃度依賴性,顯示了合成產物具有一定的抗油脂氧化能力。但是,熱失重結果分析表明,合成產物在420 ℃前后已經基本分解完全,其穩定性遠低于合成前的石榴籽多糖,這與文獻[15]報道一致,這也充分證明了有機金屬螯合物存在著自身穩定性差的缺點和不足。本試驗中,合成產物自身穩定性下降的原因可能是:合成產物由于存在著Se=O健,在熱分解過程中,C-O鍵的電子云向Se=O健轉移,增強了Se=O鍵結合強度,同時消弱了C-O鍵合力,使亞硒酸基團成為容易離去的基團,而亞硒酸基團的離去引起了多糖較快的分解,從而使合成產物穩定性下降。