豌豆肽緩解胰島素抵抗形成效果探究

崔欣悅,張瑞雪,周 明,朱 艷,陳 亮,馬 勇,谷瑞增,魏 穎

(中國食品發酵工業研究院有限公司,北京市蛋白功能肽工程技術研究中心,北京 100015)

糖尿病是以持續高血糖為基本生化特征的一種機制復雜的疾病[1]。當胰島素供應不足或胰島素在靶細胞內不能發揮正常生理作用,致使體內糖、蛋白質及脂肪代謝發生紊亂時,繼而發生糖尿病。隨著糖尿病病程的延長,機體內的代謝紊亂可造成眼、腎、神經、血管和心臟組織、器官的慢性并發癥,以致最終發生失明、下肢壞疽、尿毒癥、腦中風或心肌梗死,甚至危及生命[2-3]。糖尿病已嚴重威脅人類健康,其中II型糖尿病是最常見的糖尿病,其患病比例約占世界范圍內占糖尿病總數的 90%以上[4]。當胰島素與胰島素受體(InsR)在結合過程發生信號傳導障礙時,會影響胰島素的正常生理調節過程,發生胰島素抵抗,同時還會影響正常的細胞凋亡。胰島素抵抗對各種器官和組織產生不良影響[5-6],導致II型糖尿病的發生。

豌豆又稱寒豆、麥豆、雪豆等,是世界性第二大食用豆類。豌豆中含有豐富的蛋白質、淀粉、礦物質和多種人體必需氨基酸[7]。豌豆肽是豌豆蛋白經過酶解技術手段獲得的產物,具有較好的保水性、吸油性、乳化性和凝膠成型性,還可做為腸道營養劑促進腸道益生菌生長[8]。目前,關于豌豆水解蛋白的活性研究有一些相關報道,主要集中于豌豆蛋白的抗氧化活性[9],而對豌豆蛋白水解物對胰島素抵抗形成效果作用鮮見報道。本研究通過高濃度胰島素誘發HepG2細胞建立胰島素抵抗模型,觀察胰島素抵抗對葡萄糖消耗量的影響。同時,以豌豆肽為實驗對象通過觀察胰島素受體及凋亡蛋白含量的變化,探究不同濃度豌豆肽對胰島素抵抗形成過程中的影響,旨在為豌豆肽在糖尿病疾病上的開發和利用提供有效依據。

1 實驗材料與方法

1.1 材料與儀器

豌豆肽 中食海氏生物技術有限公司;人肝癌細胞(HepG2) 中國醫學科學院腫瘤醫院;DMEM低糖培養基 海克隆公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒、胰酶、雙抗 碧云天生物技術研究所;胎牛血清 杭州天杭生物科技有限公司;葡萄糖測定試劑盒 南京建成生物科技有限公司;PBS、胰島素溶液 北京索萊寶科技有限公司;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT) Amresco公司;InsR單抗、FITC標記的單抗鼠IgG 上海拜力生物技術有限公司;DEVD-FMK ATT公司;鹽酸二甲雙胍腸溶膠囊 北京圣永制藥有限公司。

CKX-4倒置相差顯微鏡 日本奧里巴斯有限公司;240i二氧化碳培養箱 美國Thermo公司;C6流式細胞儀 美國BD公司;AC2-6S1生物安全柜 新加坡ESCO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 HepG2細胞培養與傳代 利用含10%小牛血清,1%青霉素、鏈霉素的DMEM低糖培養液,37 ℃ 5% CO2飽和濕度下對細胞進行培養,0.25%胰蛋白酶進行消化、傳代,取對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 HepG2細胞胰島素抵抗模型的建立 利用DMEM低糖完全培養基調整細胞密度至1×105個/mL,接種于96孔板中,并設置空白組、胰島素誘導實驗組,每組6個重復。置于37 ℃培養箱培養24 h,待單層貼壁后加入三種不同濃度的胰島素培養液(1×10-5、1×10-6、1×10-7mol/L)對HepG2細胞進行誘導,時間分別控制在24、36和48 h,通過葡萄糖氫化酶過氧化氫酶法(GOP-POD)測定不同濃度胰島素誘導前后HepG2/IR細胞的葡萄糖含量及消耗量變化并測定蛋白濃度排除其影響,實驗結果以mmol/mg蛋白表示,選擇最適濃度進及誘導時間行后續試驗。

1.2.3 豌豆肽對胰島素抵抗葡萄糖消耗的影響 利用DMEM低糖完全培養基培養正常的HepG2細胞,調整細胞密度至1×105個/mL,37 ℃培養箱培養24 h,待單層貼壁后利用濃度為1×10-6mol/L的胰島素對細胞進行誘導24 h,隨后加入不同濃度豌豆肽溶液(20.0、10.0、5.0、1.0、0.8、0.5 mg/mL),并設置HepG2空白組、HepG2/IR模型組及不同濃度二甲雙胍組陽性對照(10.0、0.8 mg/mL),繼續培養24 h。利用葡萄糖氫化酶過氧化氫酶法(GOP-POD)測定不同濃度胰島素誘導前后HepG2/IR細胞的葡萄糖含量及消耗量變化并測定蛋白濃度排除其影響。

1.2.4 豌豆肽對發生胰島素抵抗HepG2細胞增殖的影響 待細胞貼壁后，按1.2.2確定的1×10-6mol/L胰島素溶液誘導HepG2/IR細胞模型方法,在96孔板誘導24 h后，隨加入不同濃度的豌豆肽溶液(20.0、10.0、5.0、1.0、0.8、0.5 mg/mL),每個濃度5個復孔,并設定二甲雙胍對照組(10.0、0.8 mg/mL)和HepG2空白對照組。37 ℃培養繼續24 h后,棄上清,每孔加入5 mg/mL的MTT 100 μL,培養箱孵育4 h,隨后棄去上清,每孔加入100 μL DMSO震蕩,在570 nm下進行檢測各組吸光值,計算細胞增殖率。

增殖率(%)=(OD實驗組/OD空白組)×100

式中:OD實驗組及OD空白組分為別實驗組和空白對照組的吸光值。

1.2.5 FCM檢測凋亡促進蛋白Caspase-3表達 利用DMEM低糖完全培養基調整細胞密度為2.0×105個/mL接于24孔板中,每孔500 μL,培養24 h待細胞單層貼壁后,移去培養基,PBS清洗一遍,隨后加入1×10-6mol/L的胰島素對細胞進行誘導24 h,加入不同濃度的豌豆肽溶液(20.0、10.0、5.0、1.0、0.8、0.5 mg/mL),并設定二甲雙胍陽性對照組(10.0、0.8 mg/mL),繼續培養24 h。利用0.25%胰蛋白酶對細胞進行消化,之后用DMEM低糖完全培養基停止消化收集細胞,加入FITC標記的Caspase-3特異性抑制物DEVD-FMK 2 μL,在37 ℃培養箱中孵育30 min,隨后離心去除上清液,PBS重懸細胞,采用流式細胞儀對細胞中的Caspase3陽性表達率進行測定[10]。

1.2.6 FCM檢測HepG2/IR細胞中InsR蛋白的表達水平 分別對胰島素誘導后的細胞加入不同濃度的豌豆肽溶液(20.0、10.0、5.0、1.0、0.8、0.5 mg/mL),并設定二甲雙胍陽性對照組(10.0、0.8 mg/mL),培養和收集細胞方法如上述1.2.4。隨后每孔加入InsR單抗1 μL,1000 r/min離心2 min,用PBS洗滌,隨后加入FITC標記的IgG抗體0.5 μL,利用流式細胞儀對其中InsR蛋白的平均熒光強度(MFI)進行檢測[11]。

1.3 數據處理

2 實驗結果

2.1 HepG2細胞胰島素抵抗模型的建立

如圖1所示,隨著誘導時間的不斷增加,葡萄糖消耗量呈不斷減少趨勢。誘導24 h時,細胞生長狀態良好,但對于葡萄糖消耗量實驗組與空白組相比無明顯差異(p>0.05)。36 h時各組細胞對葡萄糖的攝取量顯著降低,但胰島素誘導組同空白組相比不明顯(p>0.05)。在細胞誘導48 h時,葡萄糖攝取量減少趨勢穩定,1×10-6mol/L攝取量最小(p<0.05),達9.8%。因此采用1×10-6mol/L胰島素溶液誘導48 h可建立穩定的HepG2細胞胰島素抵抗模型。

圖1 胰島素抵抗對HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響Fig.1 The effect of insulin resistance on glucose consumption in HepG2 cell注:*代表相同誘導時間下,實驗組與HepG2空白組相比差異顯著,p<0.05,n=6。

2.2 豌豆肽對胰島素抵抗葡萄糖消耗的影響

擇最佳胰島素抵抗模型誘導時間48 h進行誘導,葡萄糖消耗量如圖2,模型組中葡萄糖消耗量極顯著降低(p<0.01),表明成功建立HepG2/IR模型。加入各濃度豌豆肽樣品后的細胞葡萄糖消耗量較模型組提高44%～48%,說明豌豆肽溶液可顯著促進HepG2/IR細胞葡萄糖的利用,增加糖原的合成。有研究表明,當肝臟發生胰島素抵抗后,胰島素抑制內源性葡萄糖生成的能力減弱同時肝糖原合成減少,導致肝臟葡萄糖的產生增加[12]。

圖2 豌豆肽對胰島素抵抗細胞葡萄糖消耗影響Fig.2 The effect of pea oligopeptides on glucose consumption in HepG2/IR cells注:**代表模型組與空白組相比具有極顯著差異,p<0.01; #代表實驗組與模型組相比差異顯著,p<0.05,n=6。

2.3 豌豆肽對發生胰島素抵抗HepG2細胞增殖的影響

如圖3所示,MTT法反映了活細胞數量的變化,在1×10-6mol/L的胰島素濃度誘導下,模型組對正常生長的細胞有增殖促進作用,與空白組相比作用顯著(p<0.05)。豌豆肽實驗組除0.8 mg/mL濃度外,其余(1.0 mg/mL豌豆肽除外)與模型組相比均對細胞增殖有促進作用,具有極顯著性。相反,二甲雙胍組對細胞生長具有抑制效果。

圖3 豌豆肽對胰島素誘導的肝癌細胞增殖影響Fig.3 Impact of oligopeptides from pea on the proliferation of HepG2/IR cells注:*代表模型組與空白組相比具有顯著差異,p<0.05; ##代表與模型組相比差異極顯著，p<0.01,n=5。

2.4 FCM檢測凋亡促進蛋白Caspase-3表達

胰島素誘導后的細胞中活化Caspase-3陽性率與空白組相比極顯著降低(p<0.01),降低程度達50.97%(圖4),說明在細胞產生胰島素抵抗后,凋亡促進蛋白Caspase-3的表達和活性降低抑制了Caspase激活細胞凋亡途徑,Caspase-3位于細胞凋亡信號傳導通路的中心位置,活化后直接參與切割細胞中多種結構與功能蛋白,李林靜[13]考察了肝癌細胞發生胰島素抵抗后的促凋亡蛋白Caspase-3活性,結果與本文一致。當豌豆肽進行干預作用后,陽性表達率的提高說明豌豆肽樣品促進了Caspase-3的活化,但其活化程度與陽性對照二甲雙胍水平相比還存在較大差距。

圖4 豌豆肽對胰島素抵抗肝癌細胞Caspase-3活性變化Fig.4 The change of Caspase-3 activity in HepG2/IR cells with pea oligopeptides注:**代表模型組與空白組相比具有極顯著差異,p<0.01;##:與模型組相比差異極顯著，p<0.01,n=3;圖5同。

2.5 HepG2/IR細胞中InsR蛋白的表達水平

如圖5所示,發生胰島素抵抗后細胞中InsR蛋白表達量MFI值明顯降低,與未通過胰島素誘導的空白組細胞相比,MFI由4.36×104降至2.55×104,降低41.5%(p<0.01)。在通過豌豆肽進行干預后MFI值明顯提高,豌豆肽干預濃度在1 mg/mL時MFI升高最明顯,達到3.45×104。實驗提示,高胰島素誘導可使HepG2細胞表面胰島素數目明顯減少,進而導致細胞中葡萄糖消耗量的下降,最終發生胰島素抵抗[14]。

圖5 豌豆肽對胰島素抵抗肝癌細胞InsR蛋白表達量影響Fig.5 The influence of pea oligopeptides on the expression level of InsR in HepG2/IR cells

3 結論

胰島素的生理作用調節主要是通過與各組織細胞上的胰島素受體結合后進行的,其過程中的信號傳導出現任何一個環節缺陷時,均可影響胰島素正常生理調節過程從而引起胰島素抵抗的發生[15]。HepG2細胞具有正常肝細胞的生理特性并具有高表達親和力的InsR[16]。當InsR的數目與親和力降低時,胰島素生理功能無法正常發揮,導致胰島素抵抗的發生,并引起正常細胞的凋亡抑制。本研究通過不同濃度的胰島素和誘導時間作用,建立了穩定的IR細胞模型,測定發現HepG2/IR細胞中的葡萄糖消耗量較正常HepG2細胞相比明顯降低,促凋亡蛋白Caspase-3的陽性表達率降低,InsR蛋白表達下降。當在胰島素抵抗形成過程中加以不同濃度豌豆肽溶液進行干預時,其細胞中的葡萄糖消耗量明顯上升,同時提高了InsR蛋白及Caspase-3蛋白的表達,說明有效緩解了胰島素抵抗的形成。本研究對研發具有降血糖作用的功能食品提供了理論依據,對豌豆肽的特殊肽段功能結構組成和緩解胰島素抵抗作用機理尚需進一步深入探究。