檸檬烯對熒光假單胞菌抑菌活性及機理研究

舒慧珍,唐志凌,劉 雪,陳衛(wèi)軍,陳海明,胡月英,陳文學(xué),*

(1.海南大學(xué)食品學(xué)院,海南海口 570228; 2.海南大學(xué)材料與化工學(xué)院,海南海口 570228)

食品貯藏過程中一些因素如物理、化學(xué)、酶和微生物的變化等可以導(dǎo)致食物腐敗,能夠引起食物中毒和食源性疾病,嚴重危害公共健康和安全。而引起食品腐敗變質(zhì)的最重要的原因是致腐和致病性微生物的生長,如假單胞菌屬、單核增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和糞腸球菌等[1]。嗜冷菌是一種食品在低溫貯藏條件下的關(guān)鍵腐敗微生物,能產(chǎn)生耐熱的、在食品加工設(shè)備和管道中以生物膜形式存在的脂肪酶或蛋白酶。在這種生存情況下,增強了嗜冷菌對加熱、消毒等傳統(tǒng)殺菌形式的耐受能力,從而導(dǎo)致食品的腐敗變質(zhì)[2]。熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)為假單胞菌屬嗜冷革蘭氏陰性菌,是一種廣泛存在于水和土壤中的環(huán)境污染菌,能夠在低溫環(huán)境下生長繁殖,是引起低溫條件下高蛋白和高脂肪食品腐敗變質(zhì)的優(yōu)勢菌群,也是引起敗血癥、感染性休克和血管內(nèi)凝血等疾病的條件致病菌[3],嚴重威脅人類健康。

近年來,人們常常向食品中加入一些化學(xué)防腐劑來抑制或殺死病原菌從而達到延長食品貨架期的目的,但是過量和長時間使用化學(xué)防腐劑會影響消費者的健康。山梨酸、苯甲酸等抑菌性較強但價格低廉的化學(xué)類食品防腐劑在食品行業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用,但由于其溶解性低及安全性差等問題,其局限性也越來越明顯[4]。天然防腐劑因抗菌作用強、抑菌譜廣、水溶性好、增加風(fēng)味等優(yōu)點成為近年來的研究熱點[5]。目前人們正在積極努力尋找可以替代人工合成的化學(xué)防腐劑的天然防腐劑。

檸檬烯,又稱苧烯,學(xué)名為1-甲基-4-異丙基環(huán)己烯,常溫下為無色油狀液體,具有令人愉快的檸檬樣香氣[6-7],因其抑菌、增香、抗癌、平喘等功效在食品、醫(yī)藥、日化等行業(yè)得到廣泛利用[8]。檸檬烯廣泛存在于一些天然植物中,如作為海南黑、白胡椒主要香氣成分——D-檸檬烯的含量為18.04%和5.5%[9]。檸檬烯具有廣譜抗菌性,能夠很好的抑制一些細菌及真菌的生長繁殖[10]。檸檬烯對引起肉類腐敗的常見致腐菌(大腸桿菌、黑曲霉和金黃色葡萄球菌等)都有較好的抑制和殺滅效果[11]。研究發(fā)現(xiàn),檸檬烯及其乳化液和丙酮溶液對金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌3種食源性病原菌都具有較強的抑菌作用[12-13]。

檸檬烯對熒光假單胞菌具有較好的抑制作用。較多學(xué)者研究檸檬烯對一些腐敗菌的抑菌活性時僅通過測定最小抑菌濃度、生長曲線等指標,簡要說明了檸檬烯的抑菌效果,并未深入探究其抑菌機理。本研究通過最小抑菌濃度(MIC)和生長曲線等指標確定檸檬烯對P.fluorescens的抑菌活性,并通過掃描電鏡觀察、FDA染色實驗、膜電位的測定、細胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量、ATP 含量、琥珀酸脫氫酶活性的變化等進一步探究檸檬烯對P.fluorescens的抑菌機理,為檸檬烯作為天然抑菌劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

GI54DS型高壓滅菌鍋 致微儀器有限公司;SW-CJ-1FD型無菌超凈工作臺 蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司;SPX-288型生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠;SHA-2型恒溫振蕩器 常州澳華儀器有限公司;CR22N型落地式高速冷凍離心機、S-3000型掃描式電子顯微鏡 日本日立公司;TU1810型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;Christ Alpha1型冷凍干燥機 德國Marin Christ公司;JYD-650L型超聲波細胞粉碎機 上海五相儀器儀表有限公司;WGY-10型熒光分光光度計 天津港東科技發(fā)展股份有限公司;SP-Max3500FL型多功能酶標儀 上海閃譜生物科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株活化 將熒光假單胞菌在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中傳代活化并置于30 ℃ 培養(yǎng)18～24 h,采用麥氏比濁法[14]調(diào)整菌液濃度為106～107CFU/mL待用。

1.2.2 最小抑菌濃度(MIC)的測定 采用肉湯稀釋法[15]測定最小抑菌濃度。將檸檬烯用20%乙醇溶解,二倍梯度稀釋為400、200、100、50、25、12.5、6.25 mL/L抑制液備用。分別將2 mL不同濃度抑制液與18 mL營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基混勻,使檸檬烯終濃度分別為40、20、10、5、2.5、1.25、0.625 mL/L。以加入等量無菌水和20%乙醇為空白和陰性對照。加入200 μL用無菌生理鹽水稀釋至106～107CFU/mL的菌懸液涂布均勻,倒置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,以肉眼看不見細菌生長的最小稀釋濃度為最小抑菌濃度(MIC)。

1.2.3 生長曲線的測定 通過紫外分光光度法[16]測定P.fluorescens的生長曲線。用無菌生理鹽水將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的P.fluorescens稀釋至106～107CFU/mL,并按5%(v/v)的接種量接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,加入終濃度為1×MIC、2×MIC的檸檬烯,以無菌水和20%乙醇為空白和陰性對照,放置于30 ℃,180 r/min搖床中培養(yǎng),每隔1 h通過紫外分光光度計測量600 nm處吸光值,通過吸光值繪制生長曲線反映出其生長速率。

1.2.4 細胞形態(tài)的觀察 采用掃描電鏡法[17]觀察P.fluorescens細胞外部形態(tài)的變化。在培養(yǎng)至12 h的菌懸液中加入終濃度為1×MIC和2×MIC的檸檬烯,以無菌水和20%乙醇為空白和陰性對照組。放置于30 ℃,180 r/min搖床中培養(yǎng),分別取培養(yǎng)至4、8 h的菌懸液,以6000 r/min低溫離心10 min收集菌體。使用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS,pH=7.2)洗滌3次,用20%、40%、60%、80%乙醇溶液梯度脫水后用無水乙醇洗脫3次。在-20 ℃預(yù)凍2 h,冷凍干燥12 h后取樣鍍金,在掃描電鏡上放大8000倍觀察細胞形態(tài)。

1.2.5 二乙酸熒光素染色實驗 用二乙酸熒光素(FDA)染色實驗[18]研究檸檬烯對P.fluorescens細胞膜通透性的影響。FDA是一種易通過細胞膜的無熒光的、不帶電荷的脂質(zhì)性分子,進入細胞后可被酶水解為熒光素,由于其極性而留存于細胞中發(fā)出黃綠色熒光,細胞膜受到破壞,則熒光素分子流失導(dǎo)致 FDA 熒光強度降低[21]。因此,細菌細胞膜的完整性和通透性可通過FDA熒光強度來反映。

分別將培養(yǎng)12 h的菌懸液以8000 r/min低溫離心10 min棄上清并懸浮于生理鹽水中,使菌濃度約為106～107CFU/mL。分別加入1×MIC、2×MIC濃度的檸檬烯,以無菌水和20%乙醇作為空白對照和陰性對照,置于30 ℃ 180 r/min搖床培養(yǎng)。分別取6、9、12 h的菌懸液4000 r/min離心10 min收集菌體,用PBS(pH=7.2)洗滌2次后離心棄上清,加入250 μL FDA-丙酮溶液(2 mg/mL)。常溫下放置20 min后用PBS(pH=7.2)洗滌3次,8000 r/min低溫離心10 min棄上清后重懸于PBS(pH=7.2)中,用熒光分光光度計測定平均熒光強度,激發(fā)波長為297 nm,發(fā)射波長為527 nm。

著眼于高素質(zhì)創(chuàng)新型技能型人才的培養(yǎng)目標，高職語文教學(xué)目標應(yīng)該包含以下幾個方面：一是夯實語文基礎(chǔ)知識和基礎(chǔ)能力；二是提升學(xué)生審美素養(yǎng)，提高學(xué)生的心理和情商指數(shù)，培養(yǎng)學(xué)生高雅、純正的審美情趣；三是重視語文的德育、態(tài)度、價值觀的養(yǎng)成，促進學(xué)生健全人格的養(yǎng)成；在此基礎(chǔ)上，我們提出第四種課程目標，即提升學(xué)生的創(chuàng)新理念、創(chuàng)新思維、創(chuàng)新實踐能力，進而提高語言創(chuàng)新能力、思維能力、解決問題能力為目的，以有利于學(xué)生的職業(yè)發(fā)展；通過教學(xué)目標的重新定位，把創(chuàng)新能力培養(yǎng)作為高職語文教學(xué)目標的重要構(gòu)成加以重視，并在具體的教學(xué)實踐中加以實施。

1.2.6 膜電位的測定 膜電位的大小可反映細胞的代謝活性,為了研究檸檬烯對P.fluorescens代謝活性變化的影響,根據(jù)Zhang等[19]的羅丹明123熒光染色法并進行適當(dāng)修改測定細菌的膜電位(MP)。將培養(yǎng)至對數(shù)期的菌懸液中(～1×107CFU/mL)中分別加入1×MIC和2×MIC濃度的檸檬烯,以無菌水和20%乙醇為空白和陰性對照,并于30 ℃,180 r/min搖床培養(yǎng)3 h。離心收集菌體,再用PBS洗滌2次后并溶解。將羅丹明123加入PBS中配置成1 mg/mL母液后,加入菌液中使其終濃度為2 μg/mL,在黑暗中靜置30 min后,將樣品洗滌3次并重懸于PBS中,用熒光分光光度計在激發(fā)波長為480 nm,發(fā)射波長為530 nm下測定平均熒光強度。

1.2.7 細胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量的測定 向培養(yǎng)至對數(shù)生長期的菌懸液中加入終濃度為1×MIC、2×MIC檸檬烯,以無菌水和20%乙醇為空白和陰性對照,置于搖床(30 ℃,180 r/min)分別取培養(yǎng)0、3、6、9、12 h的菌懸液在8000 r/min條件下低溫離心10 min收集菌體,用PBS(pH=7.2)洗滌3次并重懸。通過超聲細胞破碎儀在冰上破碎細胞5 min,并以10000 r/min 離心10 min,棄細胞殘渣,取上清保存于4 ℃。采用考馬斯亮藍法[20]用紫外-可見分光光度計于595 nm下測定吸光值,根據(jù)公式計算得出胞內(nèi)蛋白含量。測得的蛋白含量的標準曲線方程為:Y=0.8299X-0.0004,R2<0.9993(X表示蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(mg/mL),Y表示吸光值)。

1.2.8 ATP含量的測定 參照Sánchez等[21]的方法并稍作修改測定細胞內(nèi)ATP含量。取1.2.7超聲破碎后的樣液分別用ATP測定試劑盒測量胞內(nèi)ATP含量。將反應(yīng)后的混合物轉(zhuǎn)移至96孔板中用酶標儀測定在波長為636 nm下的吸光值。

1.2.9 琥珀酸脫氫酶(SDH)活性測定 采用SDH測定試劑盒的方法,取 100 μL 1.2.7中超聲破碎后的樣液,沖入2.6 mL 已配制好并預(yù)溫的工作液,迅速混勻并計時,將可見分光光度計波長設(shè)定為600 nm,5 s時記錄吸光度值A(chǔ)1,65 s時記錄吸光度值A(chǔ)2,計算2次吸光度差值ΔA=(A1-A2),并運用公式計算SDH活性:

SDH活性(U/mg)=[(ΔA值/0.01)/反應(yīng)時間(min)]/[取樣量(mL)×待測蛋白樣本濃度(mg/mL)]

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行方差分析,使用Origin軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬烯對熒光假單胞菌的最小抑菌濃度(MIC)

由表1可知,檸檬烯對熒光假單胞菌有較好的抑菌效果,且抑菌能力隨著其濃度的增加而增強,當(dāng)檸檬烯濃度為20 mL/L時細菌不能生長,即檸檬烯對熒光假單胞菌的最小抑菌濃度為20 mL/L,且20%乙醇溶液對熒光假單胞菌的生長沒有影響。

表1 熒光假單胞菌生長情況Table 1 The growth of P. fluorescens

2.2 檸檬烯對熒光假單胞菌生長的影響

如圖1所示,添加水和20%乙醇組的細菌生長呈現(xiàn)S型生長曲線，在2～17 h時,細菌迅速增長并在17 h時OD600分別達到2.42和2.43。20%乙醇組生長相較于空白組略為緩慢,但最終幾乎同時達到穩(wěn)定期,說明20%乙醇對細菌影響不大。但向菌液中加入終濃度為1×MIC和2×MIC檸檬烯時,菌液OD600均低于對照組。添加1×MIC和2×MIC檸檬烯組在0～12 h期間值處于較為平穩(wěn)的狀態(tài),基本上沒有變化;12～16 h OD值略有上升,之后趨于平穩(wěn)狀態(tài),最大OD值僅分別達到0.43和0.51。結(jié)果表明加入終濃度為1×MIC和2×MIC的檸檬烯能夠有效的抑制熒光假單胞菌的生長。

圖1 檸檬烯對熒光假單胞菌生長的影響Fig.1 Effects of limonene on the growth of P. fluorescens

2.3 檸檬烯對熒光假單胞菌細胞形態(tài)的影響

掃描電鏡結(jié)果如圖2所示,空白組(A1、A2)的熒光假單胞菌結(jié)構(gòu)形態(tài)較為完整,呈正常的短桿狀,形態(tài)飽滿,表面較為光滑,未出現(xiàn)細胞破損及內(nèi)容物溢出等現(xiàn)象。20%乙醇組(B1、B2)的熒光假單胞菌經(jīng)4 h的處理后細胞形態(tài)較為完好,沒有出現(xiàn)明顯變化,8 h處理后細胞形態(tài)受到的破壞很微小,大部分細胞仍呈正常的形態(tài)。而檸檬烯處理4 h后(C1、D1)的熒光假單胞菌的細胞菌體干癟,表面粗糙,部分細胞黏連在一起,形態(tài)發(fā)生扭曲變形,呈狹長或斷裂狀,可能是細胞壁和細胞膜受到破壞;作用8 h后(C2、D2),菌體形態(tài)受到嚴重破壞,菌體萎陷,細胞表面粗糙不平,呈現(xiàn)嚴重破裂坍塌和孔洞,從而引起細胞原生質(zhì)的外泄,而黏稠地原生質(zhì)則會引起嚴重的細胞聚集和重疊現(xiàn)象。且添加2×MIC檸檬烯相較于1×MIC的菌體細胞受到的破壞更為嚴重,存在更多的出現(xiàn)坍塌和孔洞的細胞。由此可見,檸檬烯能夠破壞和損傷熒光假單胞菌細胞的正常形態(tài),導(dǎo)致細胞壁和細胞膜被破壞,且破壞程度隨著檸檬烯濃度的增大而增大。還可能引起一些大分子物質(zhì)進入細胞以及一些胞內(nèi)物質(zhì)溢出如細原生質(zhì)的外滲[21],同時也會影響菌體細胞的正常代謝,甚至導(dǎo)致細胞死亡。

圖2 熒光假單胞菌的掃描電鏡圖(8000×)Fig.2 Scanning electron microphotographs of P. fluorescens(8000×)注:A1:空白組(4 h);B1:20%乙醇組(4 h);C1:1×MIC實驗組(4 h);D1:2×MIC實驗組(4 h);A2:空白組(8 h);B2:20%乙醇組(8 h);C2:1×MIC實驗組(8 h);D2:2×MIC實驗組(8 h)。

2.4 檸檬烯對P. fluorescens細胞膜通透性的影響

FDA熒光強度低表明細胞內(nèi)細胞膜完整性被破壞,引起熒光泄漏[22]。由圖3可知,處理6 h后各組的熒光強度均為200 AU左右,無顯著性差異(p>0.05),表明此時細胞膜結(jié)構(gòu)較為完整,通透性變化較小。處理9和12 h后空白對照組(水)與陰性對照組(20%乙醇)的熒光強度變化不顯著,而添加檸檬烯的熒光強度均有降低。2×MIC組的熒光強度降低更多,且12 h的實驗組的熒光強度降低也更為顯著(p<0.05)。說明添加檸檬烯9 h后能夠破壞細胞膜結(jié)構(gòu),增強細胞膜通透性,且隨著檸檬烯濃度增加,作用時間延長,破壞程度更為明顯。

圖3 檸檬烯對熒光假單胞菌FDA熒光強度的影響Fig.3 Effects of limonene on FDA fluorescence intensity of P. fluorescens注:相同時間不同小寫字母代表差異顯著,p<0.05;圖4同。

2.5 檸檬烯對熒光假單胞菌膜電位的影響

膜電位指的是存在于細胞膜內(nèi)外的電位差,作為質(zhì)子動能勢的一部分能夠參與ATP的合成,是反映菌體細胞代謝和生命活力的重要指標[23]。通過羅丹明123 的平均熒光強度來表示熒光假單胞菌的膜電位大小,結(jié)果如圖4所示。空白組和20%乙醇組中熒光假單胞菌的平均熒光強度分別為68.94和56.61 AU,加入1×MIC濃度的檸檬烯后,菌液中平均熒光強度下降至34.41 AU,當(dāng)檸檬烯濃度達到2×MIC時,熒光假單胞菌的平均熒光強度降至僅為7.33 AU。正常情況下細菌細胞膜內(nèi)外的膜電位差為100～200 mV,且膜外電壓要高于膜內(nèi)電壓,如果細胞發(fā)生去極化現(xiàn)象則會引起膜電位降低,反之,細胞發(fā)生了超極化現(xiàn)象則會導(dǎo)致膜電位升高[23]。若細胞膜被破壞,由于無機離子的自由穿越,膜電位將變成零[24]。羅丹明123可通過跨膜電位進入細胞內(nèi),加入檸檬烯后細胞的膜電位遭到破壞,釋放出羅丹明123,導(dǎo)致熒光光強度降低。結(jié)果表明加入檸檬烯降低了熒光假單胞菌的膜電位,導(dǎo)致細胞去極化和代謝失常。

圖4 檸檬烯對熒光假單胞菌膜電位的影響Fig.4 Effect of limonene on the membrane potential(MP)of P. fluorescens

2.6 檸檬烯對熒光假單胞菌細胞內(nèi)蛋白含量的影響

通過菌體內(nèi)蛋白質(zhì)等物質(zhì)的流失可表明檸檬烯對菌體膜完整性的影響。由圖5可知,在0～12 h內(nèi),20%乙醇組菌體內(nèi)蛋白質(zhì)的含量隨著細菌的生長而增加,特別是0～6 h處于迅速增加的狀態(tài),可能是因為此時細菌還處于對數(shù)生長期,細菌快速生長。而加入1×MIC和2×MIC濃度的檸檬烯則沒有引起胞內(nèi)蛋白質(zhì)的增加,兩者蛋白質(zhì)含量相差很小,說明1×MIC已經(jīng)能夠?qū)w胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量產(chǎn)生很大的影響。測定結(jié)果表明檸檬烯對熒光假單胞菌的細胞膜滲漏具有明顯的影響,且蛋白質(zhì)的滲漏現(xiàn)象隨著檸檬烯作用時間的增加越來越明顯。證明了檸檬烯通過改變菌體細胞膜的通透性,致使細菌胞內(nèi)蛋白質(zhì)的泄漏。

圖5 檸檬烯對熒光假單胞菌細胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量的影響Fig.5 Effects of limonene on intracellular protein content of P. fluorescens

2.7 檸檬烯對熒光假單胞菌細胞內(nèi)ATP含量的影響

三磷酸腺苷(ATP)是體內(nèi)能量代謝和轉(zhuǎn)換的中心,直接為生物體的生命活動提供能量[25]。ATP含量的變化關(guān)系到各個器官的能量代謝,并對細胞的各種生理病理過程很重要,檸檬烯對熒光假單胞菌ATP含量的影響如圖6所示。空白組和對照組在0～3 h時ATP含量略有增加,而實驗組ATP含量總體呈明顯增大趨勢。3 h時,1×MIC組和2×MIC組的胞內(nèi)ATP含量達到了最大值分別為10673.91 μmol/g protein和11001.02 μmol/g protein。而這可能是由于添加了檸檬烯對細胞產(chǎn)生了刺激,而細胞為了保持自身的正常生理功能出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致ATP含量的迅速上升。有研究表明,細胞處于特殊細胞形態(tài)的轉(zhuǎn)化時需要高含量的ATP[26]。在3～6 h時,ATP含量總體呈下降趨勢,且實驗組ATP含量急劇下降;6～12 h,空白組和乙醇組的ATP含量基本沒什么變化,而添加了抑菌物質(zhì)的實驗組ATP含量依然處于下降趨勢,說明在3～12 h,檸檬烯對熒光假單胞菌ATP的合成或消耗產(chǎn)生了影響,導(dǎo)致ATP含量下降。細胞在凋亡時,為了保持細胞的質(zhì)子動勢平衡,ATP含量會急劇下降[27]。而且隨著呼吸受到抑制,ATP的含量也會急劇下降。Sánchez等[21]發(fā)現(xiàn)細菌自身水解速率的增加也會導(dǎo)致細胞內(nèi)ATP含量的下降。有研究表明抑菌劑能夠通過影響三羧酸循環(huán)和還原氫的利用而對ATP的形成產(chǎn)生一定的影響[28]。

圖6 檸檬烯對熒光假單胞菌ATP含量的影響Fig.6 Effects of limonene on ATP levels of P. fluorescens

2.8 檸檬烯對熒光假單胞菌琥珀酸脫氫酶活性的影響

琥珀酸脫氫酶在微生物的細胞能量代謝中起重要作用,其活性反映了細菌細胞的能量代謝狀態(tài)[29]。琥珀酸脫氫酶是電子傳遞鏈中的關(guān)鍵酶,也是三羧酸循環(huán)中很重要的脫氫酶。琥珀酸脫氫酶受到干擾時會阻礙三羧酸循環(huán)與呼吸鏈之間的電子傳遞,從而對細胞的能量代謝產(chǎn)生影響,最終影響生物體的正常生命活動。檸檬烯對熒光假單胞菌的SDH活性影響如圖7所示,空白組和乙醇組的熒光假單胞菌細胞中SDH活性略有下降,但是變化不大,1×MIC組的熒光假單胞菌細胞中的SDH活性先上升至32.58 U/mg,隨后開始急劇下降,到12 h時下降至11.12 U/mg。但2×MIC組的熒光假單胞菌的SDH酶活則處于一種波動狀態(tài),但總體呈下降趨勢,至12 h時活性為22.69 U/mg。整體而言,實驗組的SDH活性要低于空白組。也許是檸檬烯與琥珀酸脫氫酶酶的側(cè)鏈基團反應(yīng)并改變其結(jié)構(gòu),導(dǎo)致酶的構(gòu)象變化,從而降低酶活性[30]。此外,由于細菌的呼吸鏈位于細胞膜中,與抗菌劑的接觸破壞了膜結(jié)構(gòu)并破壞了酶系統(tǒng)在呼吸鏈中的功能[31]。說明檸檬烯對熒光假單胞菌細胞有損害作用,通過抑制琥珀酸脫氫酶的活性,阻礙細胞的正常能量代謝活動,從而阻礙熒光假單胞菌的正常生長。

圖7 檸檬烯對熒光假單胞菌SDH酶活力影響Fig.7 Effects of limonene on the activity of SDH enzyme from P. fluorescens

3 結(jié)論與討論

本研究從細胞水平上,探究檸檬烯對熒光假單胞菌的抑菌機理,結(jié)果表明，檸檬烯對熒光假單胞菌具有較強的抑制和殺滅作用,其最小抑菌濃度為20 mL/L。檸檬烯能夠使熒光假單胞菌的細胞膜完整性受到破壞,滲透性增加,菌體細胞質(zhì)外滲,導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量降低和相關(guān)酶的泄漏,干擾其正常的物質(zhì)及能量代謝,甚至導(dǎo)致細胞死亡。

如今,消費者為保持健康的生活方式對天然和安全的食品產(chǎn)品越來越關(guān)注。因此,檸檬烯作為一種天然的活性物質(zhì)抑菌劑,在天然防腐劑的開發(fā)等方面具有較好價值,也逐漸成為食品保鮮領(lǐng)域的重要組成部分。本研究已探索了檸檬烯作為天然抗菌劑對于嗜冷性腐敗微生物代表的熒光假單胞菌的抑菌機理,表明檸檬烯在食品中的應(yīng)用具有良好的潛力,同時也為研究天然單萜類化合物對一些腐敗菌的抑菌機制等領(lǐng)域提供一定的參考。目前,對于檸檬烯抑菌機理的研究還不夠充分,未來的研究期望能夠進一步闡明檸檬烯對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抑菌機理,并擴大檸檬烯在食品中的應(yīng)用。