枸杞蜜的抗氧化活性及其對DNA氧化損傷的保護作用

何亮亮,趙浩安,劉新艷,張 穎,王 銀,程 妮,2,曹 煒,2,*

(1.西北大學食品科學與工程學院,陜西西安 710069; 2.陜西省蜂產品工程技術研究中心,陜西西安 710065)

自由基在機體的生命過程中發揮著重要的作用,體內過多的自由基不僅能夠攻擊DNA、蛋白質和多糖等生物大分子,而且會導致機體損傷,引發多種慢性疾病[1]。流行病學和營養學研究表明,長期攝入適量的天然抗氧化劑能夠顯著降低癌癥和心腦血管硬化等疾病的發病率[2]。從食品中尋找安全的天然抗氧化劑,保護機體免受氧化應激,預防慢性疾病的發生,已經成為研究熱點[3-4]。

枸杞蜜是蜜蜂采集枸杞(LyciumbarbarumL.)花蜜后與自身分泌物在蜂巢中釀制而成的,為我國西北地區特有的單花種蜂蜜,呈淺琥珀色,花香味淡雅,結晶細膩,深受消費者青睞[5]。玄紅專等[6]測定了洋槐、枸杞、椴樹和棗花等四種單花蜜對羥基自由基的清除能力,但研究結果未能反應枸杞蜜的抗氧化活性與生物體的相關性。單細胞凝膠電泳(Single Cell Gel Electrophoresis,SCGE)技術又被稱為彗星試驗,是一種靈敏的測定DNA損傷的方法,當DNA斷裂損傷時,在細胞電泳過程中,細胞核帶負電荷的DNA片段由核心向陽極移動,形成彗星狀的圖像,可根據尾部與頭部的熒光比例評定DNA的損傷程度[7]。淋巴細胞是機體的免疫細胞能夠準確反映機體的健康及生理狀況,而羥基自由基是最活潑的活性氧分子,是導致DNA損傷的重要因素[8]。不同蜂蜜中化合物種類和含量的不同,對特定自由基和過渡態金屬離子的親和力存在差異,因此在抗氧化活性方面表現出很大差異[9]。目前關于枸杞蜜的過渡態金屬離子絡合力、總抗氧化能力等體外抗氧化活性的研究很少,而有關枸杞蜜總酚、總黃酮含量及其對DNA氧化損傷保護作用研究還未見報道。

本文對青海枸杞蜜樣本的總酚、總黃酮含量和抗氧化活性進行初步評定,并采用彗星電泳技術,研究了枸杞蜜對小鼠淋巴細胞DNA氧化損傷的保護作用,旨為枸杞蜜的質量控制、生物活性評價和功能性食品的開發提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆明小鼠(SPF級，雌性，18～22 g，6周齡，生產許可證號：SCXK 2012-003) 由西安交通大學醫學院提供;動物飼養和實驗 符合中華人民共和國科學技術部頒發的管理規定;動物飼料 自西安秦樂飼料有限公司;枸杞蜜 樣品10個,分別用S1～S10表示,2017年8～9月份采集自青海西寧地區,經花粉孢子鏡檢分析,蜜源植物均為寧夏枸杞(LyciumbarbarumL.),所有樣品在4 ℃冰箱中避光保存;菲洛嗪(Ferrozine,純度≥98%)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、水溶性VE(Trolox,純度≥97%)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ,純度≥98%) Sigma公司;沒食子酸(純度≥99%)、蘆丁(純度≥98%) 中國醫藥(集團)上?；瘜W試劑有限公司;阿魏酸(純度≥98%)、槲皮素(純度≥99%) 阿拉丁試劑(上海)有限公司;抗壞血酸、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)、十二烷基肌氨酸鈉、三羥甲基氨酸甲烷、磷酸二氫鈉(均為分析純) 天津市北聯精細化學品開發有限公司;福林酚(Folin-Ciocalteu)試劑、30%過氧化氫(優級純)、L型抗壞血酸(純度≥99.7%)、溴化乙錠(EB)、三羥甲基氨基甲烷(Tris) 科昊生物工程有限公司。

722G可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司;HH-2型電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司;BSA-CW型電子分析天平 北京賽多利斯科學儀器有限公司;DYY-6D型電腦三恒多用電泳儀 北京市六一儀器廠;BK-FL型熒光顯微鏡 重慶奧特光學儀器有限公司;Nikon YS100型顯微鏡 尼康映像儀器銷售(中國)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 花粉分析 枸杞蜜中花粉的檢測參照GB/T 23194-2008[10],根據檢測結果,確定這10個枸杞蜜樣本是否為單花蜜。

1.2.2 枸杞蜜中的單酚類含量的測定 參考Zhou等[11]的方法,將10 g枸杞蜜溶解在100 mL pH2.0鹽酸溶液中,經XAD-2型樹脂進行吸附,用pH2.0的鹽酸溶液和蒸餾水洗脫除去糖等極性物質。甲醇溶液洗脫,洗脫液在40 ℃,-0.1 MPa真空條件下減壓濃縮至干,再用甲醇定容后經0.45 μm有機系微膜過濾。采用Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱,進樣量10 μL,分離溫度30 ℃。流動相為甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B),采用梯度洗脫。0～10 min,5%～15% A;10～20 min,15%～17% A;20～30 min,17%～30% A;30～50 min,30%～40% A;50～60 min,40%～55% A;60～70 min,55%～80% A。流速為1 mL/min。二極管陣列檢測器在280和324 nm波長下檢測,電化學檢測器設置在900 mV氧化模式下進行。

1.2.3 總酚含量(TPC)測定 枸杞蜜中總酚含量的測定采用Folin-Ciocalteu法[11]。取1 mL 0.1 g/mL的枸杞蜜溶液,加入1 mL Folin-Ciocaltue溶液,混勻后靜置5 min,加入5 mL 1 mol/L Na2CO3溶液,加蒸餾水定容至10 mL,搖勻,室溫避光1 h后在760 nm 波長測定吸光值。標準曲線用0.01～0.20 mg/mL沒食子酸繪制,回歸方程為:y=216.56x+0.079(R2=0.9987),以毫克沒食子酸當量(GAE:gallic acid equivalent)每千克枸杞蜜表示,單位為mg GAE/kg。

1.2.4 總黃酮含量(TFC)測定 枸杞蜜總黃酮測定采用Al(NO3)3比色法[12]。稱取10 g蜂蜜,加100 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液溶解后上XAD-2樹脂柱,用0.01 mol/L 100 mL鹽酸溶液淋洗除去極性物質,再用蒸餾水水淋洗至中性,后加入甲醇洗脫,收集洗脫液,于-0.1 MPa真空,40 ℃條件下濃縮至干,用甲醇溶解定容至10 mL。吸取2.5 mL上述甲醇溶液,加1 mL 5%亞硝酸鈉溶液,6 min后加入1 mL 10%硝酸鋁溶液,靜置6 min后,再加入10 mL 4%氫氧化鈉溶液,后加水至25 mL。反應15 min后在510 nm波長下測定吸光值。用0.05～1 mg/mL的蘆丁制作標準曲線,回歸方程為:y=11.327x-0.006(R2=0.9968),以毫克蘆丁當量(RE:rutin equivalent)每千克枸杞蜜表示,單位為mg RE/kg。

1.2.5 枸杞蜜的體外抗氧化活性

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力 參考Zhou等[11]方法。分別吸取0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125 g/mL枸杞蜜溶液1 mL于試管中后,加入4 mL 0.025 mg/mL DPPH甲醇溶液,混勻后25 ℃避光放置1 h,在517 nm處測定吸光值。DPPH自由基的清除率結果用IC50表示。DPPH自由基清除率計算公式:

式中:A0為空白對照溶液吸光值;A1為反應1 h后樣品溶液吸光值。

1.2.5.2 總抗氧化能力的測定(FRAP法) FRAP的測定參考Benzie等[13]的方法。取0.4 mL 0.1 g/mL枸杞蜜溶液,加入3.6 mL TPTZ工作液(TPTZ工作液由2.5 mL 10 mmol/L TPTZ溶液,2.5 mL 20 mmol/L FeCl3溶液和25 mL 300 mmol/L pH=3.6醋酸鹽緩沖液組成)混勻后室溫放置10 min后,于593 nm處測定吸光度。用0.05～0.50 mg/mL Trolox(水溶性維生素E)制作標準曲線,回歸方程為:y=37.432x-0.012(R2=0.9981),結果表示為mg Trolox/kg蜂蜜。

1.2.5.3 Fe3+還原力的測定 參照Liang等[14]的方法,取0.1 g/mL枸杞蜜溶液1 mL與2.5 mL 0.2 mol/L pH=6.6磷酸鹽緩沖液和2.5 mL 1%鐵氰化鉀混勻,50 ℃水浴反應20 min,水浴結束后加入5 mL 10% 三氯乙酸混合均勻,在25 ℃ 1000 r/min條件下離心5 min,取上清液2 mL,加2 mL蒸餾水和0.4 mL 0.1% FeCl3充分混勻后,在700 nm處測定吸光值。用0.01～0.10 mg/mL抗壞血酸制作標準曲線?；貧w直線方程為:y=0.028x+0.002(R2=0.9991),結果用mg VC/kg表示。

1.2.5.4 Fe2+絡合力的測定 取200 μL 0.1 g/mL的枸杞蜜溶液,加入濃度為1 mmol/L的FeSO4溶液100 μL、1 mmol/L的Ferrozine溶液300 μL,加甲醇補足體積至3 mL,于562 nm處測吸光值[14]。以0.025～0.050 mg/mL EDTA-2Na做標準曲線,回歸直線方程為:y=7.031x+0.016(R2=0.9995),枸杞蜜的鐵離子絡合力測定結果用mg EDTA-2Na/kg表示。

1.2.6 小鼠淋巴細胞懸浮液的制備 為保證實驗中采用的小鼠淋巴細胞為正常淋巴細胞,實驗中的4只小鼠飼喂在塑料鼠房中,飼喂室溫度為20～25 ℃,空氣濕度為70%左右,白天照明時間為14 h,小鼠自由采食,飼料和飲水充足。采集活體小鼠淋巴細胞前對小鼠提前8 h禁食,預先在4 mL離心管中加入50 μL肝素鈉抗凝劑,小鼠常規眼眶取血約0.5 mL,1∶1加入細胞分離液后4 ℃,3500 r/min條件下離心2 min,取中間淋巴細胞液層。用0.15 mol/L,pH=7.4無鈣鎂磷酸緩沖(PBS)溶液和血球計數板,將細胞濃度調至105～106個/mL,得淋巴細胞懸液。

1.2.7 枸杞蜜對羥基自由基誘導小鼠淋巴DNA氧化損傷的保護作用 參考并改進Singh等[15]的方法。將1.2.6中制得的小鼠淋巴細胞懸液分為五組進行實驗,以PBS溶液為空白對照,模型組和三個劑量組中加入10 μL 0.2 mol/L H2O2,分別在低、中、高三個劑量組中各加入10 μL 濃度為0.05、0.10、0.20 g/mL枸杞蜜溶液(以0.15 mol/L,pH=7.4 PBS溶解配制),各組再加入10 μL淋巴細胞懸液,最后用PBS溶液將各組體積補至50 μL,混勻,在37 ℃避光條件下水浴30 min。在磨砂載玻片上鋪1%正常熔點瓊脂糖,冷卻凝固后,取10 μL上述細胞混合液與加熱融化冷卻后的1%低熔點瓊脂60 μL混勻后在載玻片上鋪第二層膠,于4 ℃下冷卻凝固,后在pH10.0細胞裂解液中裂解20 min,在25 V,300 mA條件下電泳20 min后,玻片用Tris-HCL溶液中和,加入無水乙醇脫水,干燥后,加一滴10 μg/mL溴化乙錠(EB)染色,蓋片。玻片在熒光顯微鏡590 nm綠光下激發,10倍目鏡,40倍物鏡條件下觀察,拍照。每組隨機選擇50個細胞,用CASP圖像處理軟件分析各組的尾部DNA含量(Tail DNA%)、尾矩(Tail Moment)和Olive尾矩(Olive Tail Moment)。

1.3 數據處理

每個樣品平行測三次,數據表示為平均值±標準差。方差分析和顯著性分析采用SPSS 19.0軟件進行分析,采用Duncan’s multiple range test進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 枸杞蜜的花粉分析

當蜂蜜中單一花粉比例高于80%時,即為單花蜜[16]。樣本枸杞蜜的花粉分析結果如表1所示,各樣本蜂蜜中枸杞花粉所占的比例為80.4%～89.4%,表明本研究中各樣本蜂蜜均為枸杞單花蜜。

表1 枸杞蜜的枸杞花粉比例Table 1 Proportion of medlar pollen in honey samples

2.2 枸杞蜜中單酚類化合物

HPLC-ECD結果如圖1所示,所有樣本枸杞蜜中均含有沒食子酸、阿魏酸和槲皮素,含量如表2所示。不同枸杞蜜樣品的酚酸含量也有顯著差異(p<0.05),沒食子酸含量為8.425～16.354 mg/kg、阿魏酸含量為5.801～13.004 mg/kg和槲皮素含量為0.702～1.806 mg/kg,且沒食子酸含量明顯高于阿魏酸和槲皮素含量。Tenore等[17]的研究結果顯示枸杞蜜中的沒食子酸含量顯著高于柑橘蜜、檸檬蜜、杏花蜜等三種蜂蜜,而Liang等[14]的研究表明,棗花蜜中沒食子酸含量為0.25～0.32 mg/kg,遠低于枸杞蜜中的沒食子酸含量。因此沒食子酸可以作為一種潛在的花源標志物用于鑒別枸杞蜜和其他淺色蜜。

表2 枸杞蜜中沒食子酸、阿魏酸和槲皮素含量Table 2 Contents of gallic,ferulic and quercetin of medlar honey

圖1 樣品色譜圖Fig.1 Chromatogram of samples注:A標準品;B枸杞蜜樣品;峰1:沒食子酸;峰2:阿魏酸;峰3:槲皮素。

2.3 枸杞蜜的總酚和總黃酮含量

蜂蜜的總酚含量與蜜源植物、氣候、收獲技術和貯藏條件等因素相關,因此各蜂蜜樣品的總酚含量存在差別[5]。如圖1結果所示,在枸杞蜜中發現有酚酸類和黃酮類物質,因此測定其總酚和總黃酮含量[14]。與Tenore等[17]的研究結果一致,實驗中測得枸杞蜜的總酚酸、總黃酮含量分別為401～532 mg GAE/kg和7.19～12.26 mg RE/kg。

2.4 枸杞蜜的體外抗氧化活性

2.4.1 DPPH自由基清除能力 枸杞蜜樣品對DPPH自由基清除能力結果如圖2所示,所有枸杞蜜樣品對DPPH自由基均有清除作用,枸杞蜜對DPPH自由基清除活性的IC50值為36.72～52.32 mg/mL。曹煒等[18]的研究結果表明蜂蜜的DPPH自由基清除能力主要與其總酚含量相關。實驗中枸杞蜜的總酚含量越高,對應的DPPH自由基清除IC50值越小,自由基清除能力越強。由表3和圖2可得,樣品S9的總酚含量最高,其DPPH自由基清除能力清除能力也最強。

圖2 枸杞蜜的DPPH自由基清除能力Fig.2 DPPH scavenging activity of medlar honey注:不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05);圖3～圖5、圖7同。

表3 枸杞蜜中總酚和總黃酮含量Table 3 The contents of total phenolic acid and total flavonoids of medlar honey

2.4.2 總抗氧化能力(FRAP) 對10種枸杞樣品總抗氧化能力進行評價,實驗結果如圖3所示,枸杞蜜的FRAP值為122.5～187.6 mg Trolox/kg。不同枸杞蜜樣品的FRAP值如圖3所示,S3樣品的FRAP值最小為122.5 mg Trolox/kg,而S9號樣品的FRAP值最大為187.6 mg Trolox/g。FRAP法不是測定具體某種自由基,而是樣品總的還原能力,一些學者用此法測定樣品的總抗氧化活性[19]。Can等[20]的研究結果顯示柑橘蜜的FRAP值為57.3～89.2 mg Trolox/kg,遠低于枸杞蜜的FRAP值,表明柑橘蜜的抗氧化活性弱于枸杞蜜,可能與蜂蜜的產地、氣候的因素相關。枸杞蜜產地為我國西北地區,是典型的干旱半干旱地區,而柑橘蜜的產地為濕潤區,一般干旱半干旱地區蜂蜜的抗氧化活性高于濕潤區蜂蜜的抗氧化活性[21]。

圖3 枸杞蜜的FRAPFig.3 FRAP of medlar honey

2.4.3 枸杞蜜的Fe3+還原力測定 10種枸杞蜜樣品鐵離子還原力實驗結果如圖4所示,枸杞蜜的Fe3+還原力平均值為0.214～0.427 mg VC/kg。枸杞蜜的Fe3+還原力有較大的差異性,其中S9號枸杞蜜樣品的Fe3+還原力能力最強,約為S3枸杞樣品的2倍。Wang等[22]的研究結果表明蜂蜜的Fe3+還原力與蜂蜜的采收時間、運輸和貯藏溫度等因素相關,而在實際生產中蜂蜜的采收時間、運輸和貯存條件很難保持一致,因此不同枸杞蜜樣本的Fe3+還原力呈現較大的差異性。

圖4 枸杞蜜的Fe3+還原能力Fig.4 Fe3+ reducing activity of medlar honey

2.4.4 枸杞蜜對Fe2+的絡合力 如圖5，測定的10個枸杞蜜樣品均對Fe2+具有絡合力,在27.4～41.7 mg EDTA-2Na/kg之間。Sun等[23]認為蜂蜜對Fe2+的絡合合能力主要與其黃酮類物質獨特的C6-C3-C6結構和碳橋上特定的酚羥基能夠高效的絡合過渡態金屬離子有關。Wang等[24]研究結果顯示荊條蜜的Fe2+的絡合力為3.18～41.7 mg EDTA-2Na/kg。Tenore等[17]研究結果表明,花蜜的成分受植物的生長環境和氣候影響較大,接受充足陽光的植物比其他植物具有更多的多酚含量,而荊條蜜產地的緯度與枸杞蜜相似,因此兩種蜜的Fe2+的絡合力無顯著性差異。

圖5 枸杞蜜的Fe2+絡合能力Fig.5 Ferrous ion-chelating activity of medlar honey

2.5 總酚、總黃酮含量與抗氧化活性的相關性分析

枸杞蜜的抗氧化活性與總酚、總黃酮含量的相關性分析結果如表4所示。酚類物質中的酚羥基可以提供電子,具有較強的還原能力,是蜂蜜具有抗氧化活性的化學基礎。枸杞蜜的DPPH自由基清除能力和Fe3+還原能力與其總酚含量均顯著相關(p<0.05,p<0.01),表明枸杞蜜清除DPPH自由基和Fe3+還原能力主要是通過酚羥基中的氫原子的還原性。枸杞蜜的Fe2+絡合能力與其總黃酮含量極顯著相關(p<0.01),是由于黃酮類物質特殊的化學結構,使Fe2+能夠螯合在黃酮類化合物母核的3-羥基和4-羰基之間[25]。

表4 枸杞蜜的總酚、總黃酮含量與抗氧化活性的相關性分析Table 4 Correlation analysis between total phenolic content and antioxidant activities of medlar honey

2.6 枸杞蜜對H2O2誘導的小鼠淋巴細胞DNA損傷的保護作用

采用羥基誘導小鼠淋巴細胞作為DNA損傷模型,研究枸杞蜜對DNA氧化損傷的保護作用。枸杞蜜S9的總酚、總黃酮含量是10個樣本蜜中最高的,因此選用S9樣品進行彗星電泳實驗。如圖6a所示,空白對照組無明顯DNA損傷,細胞呈圓形,模型組(圖6b)因加入H2O2的能夠通過Fenton反應產生羥基自由基對DNA結構造成嚴重的損傷,細胞呈現明顯的彗星式拖尾,而加入枸杞蜜的各劑量組(圖6c～圖6e)與模型組相比拖尾明顯減弱。

圖6 小鼠淋巴細胞彗星電泳實驗結果Fig.6 Results of the comet assay for the DNA damage in lymphocytes of mice注:a對照組;b模型組;c低劑量組;d中劑量組;e高劑量組。

由于細胞間存在個體差異,為避免受極值的影響,各實驗組隨機選擇細胞50個,統計尾部DNA含量、尾矩和Olive尾矩,以比較各組數據分布和組間差異。結果如圖7所示,三個加入枸杞蜜保護組淋巴細胞的尾部DNA含量、尾矩和Olive尾矩,均顯著低于模型組(p<0.05)。彗星電泳實驗結果表明枸杞蜜在0.05～0.2 g/mL濃度范圍內能夠減輕由羥基自由基誘導的小鼠淋巴細胞DNA氧化損傷。對比低、中、高三個劑量組,當枸杞蜜濃度增加時,彗星尾部DNA比例(依次為63.5%、50.4%和35.0%),尾矩(依次為266.9、166.8和91.5)和Olive尾矩(依次為131.7、91.6和57.4)依次減小。多元線性回歸結果顯示,尾部DNA含量、尾矩和Olive尾矩與枸杞蜜濃度的線性回歸方程決定系數依次為:R2=0.9775,R2=0.9341,R2=0.9425,表明枸杞蜜對小鼠淋巴細胞DNA的保護作用存在明顯的劑量-效應關系。

圖7 彗星尾部DNA含量、Olive尾矩和尾矩Fig.7 Percents of DNA,olive tail moment and tail moment in the comet tail

羥基自由基在活性氧中對DNA攻擊能力最強,能夠直接導致DNA開環甚至斷裂[26]。當機體內的自由基過多,機體無法正常清除時會發生氧化應激,外源抗氧化劑能夠起到預防自由基對DNA生物大分子的氧化損傷[27]。枸杞蜜對DNA氧化損傷的保護機制可能是蜂蜜中酚類化合物能夠直接清除羥基自由基或通過酚羥基絡合過渡態金屬離子抑制Fenton反應從而減少羥基自由基。張華等[28]的研究結果表明,酚酸類物質的抗氧化活性高于黃酮類物質,枸杞蜜中的酚酸含量較高。枸杞蜜中黃酮類物質含量較低,對Fe2+絡合力弱,因此枸杞蜜對DNA的主要保護機理可能為通過酚酸類物質的酚羥基直接清除羥基自由基,而絡合過渡態金屬離子抑制Fenton反應為輔助途徑。本研究結果表明枸杞蜜能夠減輕羥基自由基誘導的小鼠淋巴細胞DNA氧化損傷,且其對DNA氧化損傷的保護作用與枸杞蜜濃度存在劑量-效應關系。

3 結論

西北地區特有的枸杞蜜是單花種蜜,具有較強的還原能力、DPPH自由基的清除活性和抗氧化能力,在體外環境中能夠對羥基自由基誘導的小鼠淋巴細胞DNA的氧化損傷起到較好的保護作用。枸杞蜜的抗氧化活性不僅與其總酚含量呈顯著的正相關(p<0.05),而且對羥基自由基誘導的小鼠淋巴DNA氧化損傷的保護作用也呈量效關系(p<0.05)。枸杞蜜對DNA氧化損傷的保護機制主要與其酚類物質有較強的清除自由基活性有關,而枸杞蜜中抗氧化成分的分子結構特征、抗氧化機制及其各抗氧化成分間的協同相互作用還有待進一步深入研究。