牛至精油羧甲基纖維素活性包裝膜制備及其抗氧化和抗菌性能研究

譚瑞心,張萬剛,周光宏

(南京農業大學食品科技學院，肉品加工與質量控制教育部重點實驗室, 江蘇高校肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心,江蘇南京 210095)

活性包裝是一種新型的包裝技術,在食品保藏和產品安全領域有著越來越重要的地位[1]。而活性包裝目前大多通過向包裝膜材料上噴灑、涂覆或添加功能性物質來實現其作用[2]。選擇可生物降解的天然大分子物質為活性包裝膜的基材,將天然的功能性成分加入到其中作為活性物質,制備具有指定功能的活性包裝膜材料,它區別于傳統的塑料高分子聚合物,無害無污染并且賦予包裝新的活性功能,對食品的貯藏保鮮具有重要的意義[2]。

羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose,CMC)是一種從纖維素中分離出來的陰離子多糖[3]。它具有無毒、生物兼容、可生物降解并且具有良好的膜成型性能,被認為是一種潛在的可食用薄膜或涂層材料[4]。有研究表明在CMC中添加精油的涂層可提高保護效果并延長烤葵花籽和魚肉的貯藏期[5-6]。在精油中,牛至精油(oregano essential oil,OEO)被認為是最有效的抗菌劑之一,它可以防止多種微生物的生長,包括細菌、酵母菌和真菌等[7]。牛至精油的抗菌和抗氧化活性可歸因于其中含有大量的酚類化合物,主要是精油中的香芹酚和百里香酚發揮作用[8]。前期研究發現,在活性包裝膜中添加牛至精油能夠發揮出良好的性能[9-10]。但目前大多研究只針對抗氧化或抑菌單一活性功能進行探究,且將牛至精油應用到具有可降解功能性的羧甲基纖維素中的研究鮮有報道。本研究將牛至精油作為活性成分加入到羧甲基纖維素中作為活性物質,制備具有抗菌和抗氧化活性的包裝膜,并探究牛至精油對膜物理、化學等性能的影響,為活性包裝膜的實際生產和應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羧甲基纖維素(柱層析)、牛至精油(98%) 上海源葉生物科技有限公司;甘油(AR)、吐溫80 南京晶格化學科技有限公司;胰蛋白胨大豆瓊脂培養基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯培養基(TSB) 青島高科技工業園海博生物技術有限公司;金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureu)和大腸桿菌(Escherichiacoli)菌種 南京農業大學肉品中心實驗室保藏。

T-25數字勻漿機 德國IKA公司;CR-400便攜式色差儀 日本Konica Minolta公司;千分測厚儀 浙江余姚正量工量具廠;磁力攪拌水浴鍋 金壇市城西富威實驗儀器廠;M2e酶標儀 美國分子儀器公司;HVE-50高壓滅菌鍋 日本Hirayama公司;S-3000N掃描電鏡 日本Hitachi公司;傅里葉變換紅外光譜 美國Thermo Nicolet Corporation公司;質構分析儀 英國Stable Micro System公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牛至精油-羧甲基纖維素活性包裝膜的制備 參照Han[11]的方法并經預實驗調整,稱取CMC 1.0 g(1% w/v)加入蒸餾水中,80 ℃下磁力攪拌至完全溶解,向其中加入0.5 mL(0.5% v/v)的甘油作為增塑劑,繼續磁力攪拌1 h后形成均勻、透明的膜液。然后將牛至精油和吐溫80以10∶1的體積比進行混合后,按照0、1、2、3%(v/v)的精油含量,0、0.1、0.2、0.3%(v/v)的吐溫80含量分別加入膜液中,在13500 r/min的速度下均質4 min得到成膜基液。在55 ℃下經過靜置脫泡處理后將100 mL成膜液倒入直徑為15 cm的培養皿中,在40 ℃的鼓風干燥箱中干燥20 h后揭膜分別貼上對照、OEO1、OEO2和OEO3的標簽保存于密封袋中。

1.2.2 厚度測量 用精確度為0.001 mm的測厚儀精密測量薄膜厚度,隨機測量每個膜樣本中心及周邊15處,取平均值。

1.2.3 顏色測量 使用色差儀測量膜的顏色,參照CIE LAB色度參數:L*為暗(0)到亮(100),a*代表紅色(+)到綠色(-),b*為黃色(+)到藍色(-)。測量前使用標準白板校正顏色,以白色標準板為背景在膜上隨機選擇15個點進行測量。總色差(ΔE)使用下面的公式計算:

式中:ΔL*、Δa*、Δb*指的是樣品和作為背景的差值。

1.2.4 機械性能測量 機械性能的測定參照Mulla[12]等的方法進行調整,采用質構分析儀進行測定。按照要求組裝儀器后,將膜樣裁剪成2 cm×8 cm的矩形,使用ATG模式進行測定。測定的初始夾距為40 mm,拉伸速度為0.8 mm/s,拉伸距離為25 mm。利用公式計算得到斷裂伸長率(E)和抗拉強度(TS)。計算公式如下:

式中:TS為拉伸強度,MPa;P為斷裂時最大張力,N;S為樣品面積,mm2。

式中:E為斷裂伸長率,%;ΔL為斷裂時的伸長量,mm;L為原長,mm。

1.2.5 DPPH自由基清除能力 膜的抗氧化能力參照Dashipour[13]的試驗方法,并做適當的調整。稱取25 mg膜樣剪碎后置于5 mL蒸餾水中,充分攪拌使其溶解,從中取出0.1 mL加入3.9 mL的DPPH甲醇溶液(0.1 mmol/L)溶液中室溫下避光孵育60 min。以純甲醇作為空白對照,測定517 nm處樣品的吸光度,并用以下公式進行計算得到自由基清除能力:

式中:A空為空白的吸光值,A樣為樣品的吸光度值。

1.2.6 紅外光譜分析(FT-IR) 用傅里葉變換紅外光譜儀對膜樣進行分析,使用ATR模式記錄膜在4000～500 cm-1的紅外光譜,分辨率為4 cm-1,每個樣本在室溫下重復掃描20次[14]。

1.2.7 微觀結構 利用掃描電子顯微鏡觀察膜的水平表面和橫斷面形態,切取適當面積的膜樣分別水平和豎直黏貼到相應的底座上。將制好的膜樣在液氮下處理后截取橫斷面,分別將膜的水平表面和橫斷面固定到樣品臺上,噴金處理后在5 kV的加速電壓下,分別在300和1000放大倍數下進行電鏡觀察。

1.2.8 抑菌活性 膜的抑菌性能參照Klangmuang[14]的方法,利用瓊脂擴散法進行膜樣抑菌性的測量。利用在固體瓊脂上抑菌圈的大小來衡量膜樣的抑菌性能,選擇兩種典型的食物腐敗菌包含革蘭氏陰性菌(大腸桿菌),革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌)進行試驗。將膜樣裁剪成直徑為6 mm的小圓片放在涂有100 μL菌液(108～109cfu/mL)的固體培養基上,將其放入37 ℃的培養箱中培養24 h后拿出,測量并記錄抑菌圈的直徑。

1.3 數據處理

所得數據用SAS 8.1進行方差分析,用Factorial ANOVA進行顯著性分析,實驗重復數為5。

2 結果與分析

2.1 羧甲基纖維素膜的顏色分析

應用于食品包裝的活性包裝膜,其顏色是衡量消費者接受程度的指標之一。從表1可以看出L*值隨著精油添加量的提高呈現顯著降低的趨勢(p<0.05),膜樣表面逐漸變暗,這是由于牛至精油中的酚類物質吸收了短波長的光而導致的[15]。含有牛至精油膜樣的a*值均顯著高于對照組,其中1%和2%組之間沒有顯著性差異,濃度3%膜樣的a*值與低濃度相比顯著增加(p<0.05)。ΔE和b*值隨著精油添加量的提高呈現顯著上升的趨勢(p<0.05)。膜樣表面變黃變紅的主要原因是牛至精油本身的黃棕色使活性膜顏色加深[16],但a*值和b*值數值較小,在膜的表面呈現出一定的棕黃色。在Benavides[17]的研究中增加藻酸鹽膜中牛至精油的含量也得到類似的結果。

表1 牛至精油對羧甲基纖維素膜顏色的影響Table 1 The effect of oregano essential oil on the color of carboxymethyl cellulose film

2.2 羧甲基纖維素膜的厚度和機械性能分析

通過預實驗確定活性膜中各成分添加含量,將精油添加最高濃度設置為3%。當活性膜中含有高濃度的精油時,由于乳化液的不穩定性和脂質的分散能力而導致不規則的油脂分布,從而影響膜的性質形成不同厚度的膜樣[18]。從表2我們可以看到膜樣的厚度均小于0.2 mm,厚度隨精油添加量增加而顯著提高(p<0.05)。這與Herrera[19]的研究中添加油到膜中的結果相同,而Perdones[20]的研究中發現,高濃度精油含量的活性膜在干燥過程中會因為精油的損失而使膜的厚度降低。這可能是由于添加精油濃度過高導致的,而本實驗中最高濃度為3%避免了此情況的發生。

表2 牛至精油對羧甲基纖維素膜厚度和機械強度的影響Table 2 The effect of oregano essential oil on the thickness and mechanical strength of carboxymethyl cellulose film

包裝材料需具有抗斷裂和耐磨損的能力,從而在產品處理、包裝、運輸和儲藏過程中對產品起到保護作用。抗拉強度是指薄膜能夠承受的最大拉伸能力,而斷裂伸長率是測試樣本在斷裂前的最大長度變化[21]。從表2可以看出,對照組的斷裂伸長率顯著高于其他處理組,1%、2%和3%精油處理組間無顯著差異(p>0.05)。加入精油的活性膜抗拉強度隨添加量的增加而顯著降低(p<0.05),這種變化與其他研究[15,22-23]將精油加入到多糖制成的膜中得到的結果一致。抗拉強度和斷裂伸長率與膜的微觀結構和分子之間的相互作用力有關[16]。油脂的擴散使油和聚合物的弱交互作用部分替代了聚合物之間的強交互作用,從而使膜的網絡結構變差,降低膜的抗拉強度[24]。本實驗樣品主要以包覆食品的形式作為內包裝,可以一定程度的接受抗拉強度的降低。

2.3 羧甲基纖維素膜的微觀結構分析

從圖1可以看出,對照組薄膜的表面結構與處理組相比更加均勻和光滑,其斷面結構較為緊致、平整,體現出羧甲基纖維素良好的成膜性能。而添加牛至精油的薄膜則呈現出較為松散的結構,在膜的表面可以看到有圓球狀的突起和凹陷,并且隨著精油濃度的增加逐漸變大。OEO1膜樣的表面可以看到有少量孔洞,隨著精油的濃度增加膜樣表面微孔變多,形狀不規則且分散不均勻。精油正是從膜樣表面的微孔釋放出來從而實現其自身的特性。

圖1 牛至精油對羧甲基纖維素膜微觀結構的影響Fig.1 Effect of oregano essential oil on the microstructure of carboxymethyl cellulose film注:水平表面放大倍數為300,橫截面放大倍數為1000。

從薄膜的橫截面來看,對照組的斷面更加整齊均勻,處理組的斷面可以看到很多形狀不一的微孔和顆粒狀突起,這與掃描電鏡的樣品表面結果相符。這歸因于精油濃度增加產生更大的團塊和高頻率的碰撞,絮凝率上升使矩陣結構更加不均勻[25-26]。均質形成的氣泡和加入的脂滴與連續的多糖網狀結構相結合[11],這也是精油能夠從膜中釋放出來實現其本身的活性功能的原因。在膜的干燥過程中,表面的收縮力也是造成乳化劑網絡結構中不規則油滴形狀的可能因素,同時油滴的蒸發也會在膜的表面形成微孔[13]。其他研究[27-28]將精油添加到多糖膜中也得到相似的結果。

2.4 羧甲基纖維素膜的紅外光譜分析

從圖2可以看出,在特征區中膜樣在波數3700～3000 cm-1之間的吸收峰是由于官能團O-H中氫鍵的伸縮振動,主要來自于羧甲基纖維素。在波數3000～2800 cm-1之間有兩個峰,分別為-CH3和-CH2中飽和C-H鍵的伸縮振動[29]。波數在1800～1550 cm-1之間的吸收峰為C=O的伸縮振動[14]。C-H鍵或N-H的變形振動在1500～1300 cm-1波長處出現,波長在1150～1000 cm-1吸收峰為C-O鍵的伸縮振動及O-H鍵的彎曲震動[30]。Moyano將檸檬精油加到藻酸鈉膜中的研究也得到類似的結果[31]。對照組的膜樣和添加牛至精油的膜呈現出相似的峰值,在1700～1000 cm-1之間加入精油后吸收峰變強,這說明加入的精油與羧甲基纖維素并沒有發生化學變化,只是物理性的結合[32]。

圖2 牛至精油對羧甲基纖維素膜紅外光譜的影響Fig.2 The effect of oregano essential oil on carboxymethyl cellulose film in infrared spectrum

2.5 羧甲基纖維素膜的DPPH自由基清除能力分析

自由基清除能力是用來衡量膜抗氧化能力的主要指標,DPPH測定是衡量樣品自由基清除能力非常簡便有效的方法[33]。從圖3的結果可以看到,添加精油的薄膜DPPH自由基清除能力在31.35%～45.58%之間,與對照組差異顯著(p<0.05)。精油濃度為2%和3%活性膜的DPPH自由基清除能力均顯著高于1%精油濃度(p<0.05)。但3%精油濃度的活性膜自由基清除能力與2%濃度相比并不顯著(p>0.05),這可能由于高濃度的精油經過乳化均質后,在干燥過程中的揮發限制了活性膜抗氧化能力的提高的緣故。在膜中添加精油或植物提取物可以提高膜的抗氧化性質,這與前人的研究結果相一致[34-36]。牛至精油中的香芹酚、百里香酚和聚傘花素等主要成分是為其提供抗氧化活性的主要原因[37]。

圖3 牛至精油對羧甲基纖維素膜DPPH自由基清除能力的影響Fig.3 Effect of oregano essential oil on DPPH scavenging capacity of carboxymethyl cellulose film注:小寫字母不同表示差異顯著(p<0.05)。

2.6 羧甲基纖維素膜的抑菌性分析

通過抑菌圈法測定膜的抗菌活性強弱,選用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌這兩種具有代表性的微生物進行檢測[38]。由表3可以看出,對照組沒有出現抑菌圈,這表明羧甲基纖維素無抑菌性。而添加牛至精油的活性膜對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈隨著精油含量的增加顯著提高(p<0.05),這主要是由于精油中的酚類物質發揮的作用[17]的緣故,這與Sanchezgonz將茶樹精油添加到殼聚糖膜中的研究結果一致[39]。精油與羧甲基纖維素的結構相結合,可以使酚類物質釋放從而抑制微生物的生長[35]。

表3 牛至精油對羧甲基纖維素膜抑菌能力的影響Table 3 The effect of oregano essential oil on the bacteriostatic ability of carboxymethyl cellulose film

3 結論

加入牛至精油能夠顯著改變膜的厚度、顏色和機械性能。掃描電鏡發現,牛至精油使膜樣表面和內部結構發生變化,微孔增多結構變的不均勻,而這也是精油從膜中釋放出來發揮其活性的原因。從紅外光譜的結果可以看到,牛至精油的加入沒有與羧甲基纖維素發生化學反應。隨著精油濃度的提高,酚類物質發揮作用使膜樣的抗氧化性能有顯著的上升,并顯著提高了抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長的能力。綜合考慮膜的感官質量和成本,含有2%精油活性膜具備良好的物理性能的和較強的抗菌和抗氧化活性,可以有效地防止食品腐敗變質,延長食品的貨架期。