GCMS分析牛樟芝多糖的單糖組成及其抗氧化活性

楊彬君,易 駿,龔業滔,吳巖斌,吳錦忠,吳建國,*

(1.福建中醫藥大學藥學院,福建福州 350122; 2.福建教育學院理科部,福建福州 350001)

牛樟芝(AntrodiacinnamomeaT. T. Chang & W. N. Chou)又名樟芝、樟菇、牛樟菇、紅樟芝、血靈芝,屬擔子菌門菌蔁綱無褶菌目多孔菌科薄孔菌屬。牛樟芝是珍貴的藥用大型真菌,野生牛樟芝僅生于臺灣特有樹種牛樟樹干腐朽心材內壁[1]。牛樟芝在臺灣民間已有200多年的應用歷史,主要用于解酒、解食物中毒、止腹瀉和止吐作用等。目前已從牛樟芝中分離得到的化學成分逾百種,主要有多糖、三萜、馬來酸衍生物、安卓奎諾爾等化學成分[2]。

現代藥理學研究表明牛樟芝多糖具有多種生物活性,包括抗腫瘤[3]、抗炎[4]、抑制血管生成[5]、抗感染[6]、改善免疫功能[7]、調節血糖血脂[8]、保肝[9]等多種功效。多糖具有復雜的化學結構及豐富的生物活性,由于多糖結構復雜,通常對提取得到的粗多糖水解為單糖后再進行檢測分析[10],常用的方法主要有高效液相色譜法(HPLC),薄層色譜法(TLC),氣相色譜法(GC)、高效陰離子交換色譜安培檢查法(HPAEC-AED)等方法,其中,TLC法靈敏度低,分離效果較差;HPAEC-AED法價格昂貴,酸水解的多糖降解不徹底影響定量分析,目前,HPLC和GC法應用較為廣泛,具分離速度快、分離效果好,重現性好等優點[11]。Su等[12]采用PMP柱前衍生化法,通過HPLC檢測結果發現牛樟芝多糖的單糖組成為巖藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、木糖。目前,尚未發現GC-MS法檢測牛樟芝多糖單糖組成的相關報道。

本實驗以水提醇沉法提取牛樟芝多糖,利用紫外可見分光光度法測定多糖的總糖含量;首次應用GC-MS分析多糖的單糖組成;最后,評價多糖對DPPH、ABTS和OH自由基的清除能力,旨在為牛樟芝的開發和質量控制提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛樟芝子實體 由汕頭市君研生物科技有限公司提供,經吳錦忠教授鑒定為多孔菌科薄孔菌屬植物牛樟芝子實體;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 德國ALDRICH公司;2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS) Sigma公司;核糖醇(批號:K22F8S29663)、D(+)-巖藻糖(批號:ASIM7L15555) 上海源葉生物科技有限公司;D(-)-阿拉伯糖(批號:15011315)、L-鼠李糖(批號:14102217) 上海士鋒生物科技有限公司;D(+)-葡萄糖(批號:D0806AS)、D-甘露糖(批號:M0425AS) 大連美倫生物技術有限公司;半乳糖(批號:100226-201105) 中國食品藥品檢定研究院;維生素C(VC) 北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司;2,6-二叔丁基對甲酚(BHT) 上海華籃化學科技有限公司;三氟乙酸、鹽酸羥按、吡啶、乙酸酐、氯仿、甲醇、乙醇、丙酮、硫酸、苯酚、水楊酸鈉、過硫化鉀、過氧化氫、硫酸亞鐵 分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

7890B/5977A 型氣相色譜-質譜聯用儀 美國安捷倫公司;UV-1800紫外可見分光光度計 日本島津儀器有限公司;RT-04小型高速粉碎機 北京燕山正德機械設備有限公司;AR2310千分之一電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司;MS105DU萬分之一天平 瑞士METTLER TOLEDO公司;DZF-6051真空干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;RE-52系列旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;HH-S型水浴鍋 鄭州長城科工貿有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多糖的提取 牛樟芝藥材切片,干燥后粉碎,過40目篩,60 ℃干燥至恒重。取牛樟芝粉末20 g,400 mL蒸餾水回流提取3次,真空泵抽濾,濾液合并濃縮,加入無水乙醇使乙醇終濃度達80%(V/V),4 ℃靜置24 h,室溫下離心(3000 r/min,15 min),棄去上清液,以少量無水乙醇、丙酮清洗三遍,60 ℃烘干,稱重,計算牛樟芝多糖得率[13]。

多糖得率(%)=粗多糖質量×100/牛樟芝粉末質量

1.2.2 粗多糖的總糖含量測定

1.2.2.1 標準曲線的繪制 精密稱取無水葡萄糖10.2 mg,加蒸餾水定容至100 mL,即得濃度為0.102 mg/mL的葡萄糖標準溶液。精密量取上述對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.5和1 mL至具塞試管中,加水補至1 mL,空白對照加水1 mL,加入1 mL 5%的苯酚溶液,5 mL的濃硫酸,混勻,于100 ℃水浴加熱20 min,取出,冰水浴5 min冷卻至室溫,取對照品溶液用紫外分光光法在400～600 nm進行掃描,結果顯示在488 nm處有最大吸收,因此,本實驗以488 nm作為檢測波長[14]。

1.2.2.2 總糖含量測定 精密稱取牛樟芝多糖粉末10 mg,加水定容至25 mL,即得0.4 mg/mL的供試品溶液。取適量樣品溶液,平行三份,按上述的操作方法進行測定粗多糖的總糖含量。

1.2.2.3 方法學考察 精密度:取濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖對照品溶液,按上述的方法進行測定,平行六份,計算吸光度的RSD值。

重復性:稱取牛樟芝粗多糖六份,配制成0.2 mg/mL的供試品溶液,按上述的方法測定吸光度,計算多糖總糖含量的RSD值。

穩定性:精密量取供試品,按上述的方法測定吸光度,每15 min,測定一次,在2 h內顯色穩定,計算吸光度的RSD值。

加樣回收率:取已知含量的樣品六份,精密加入等量的無水葡萄糖制備成供試品溶液,按上述的方法測定吸光度,計算加樣回收率。

1.2.3 多糖單糖組成的GC-MS分析

1.2.3.1 多糖的水解及糖腈乙酸酯衍生化 精密稱取牛樟芝多糖10 mg于具塞試管中,加入2 mL的2 mol/L三氟乙酸,密封,于110 ℃水解2 h,水解液揮干,再反復用甲醇溶解蒸干以除去殘留三氟乙酸,真空濃縮至干,得牛樟芝多糖的水解物,置于4 ℃冰箱中備用。精密稱取鼠李糖1.27 mg、巖藻糖1.36 mg、阿拉伯糖1.24 mg、甘露糖1.30 mg、半乳糖1.6 mg、葡萄糖1.63 mg,加入20 mg鹽酸羥胺,加入1.1 mg/mL內標側金盞花醇的吡啶溶液1 mL,于100 ℃中水浴30 min,取出,冷卻后加入1 mL乙酸酐,100 ℃繼續反應30 min,取出,揮干,得到糖腈乙酸酯衍生物,氯仿定容至5 mL,0.22 μm濾頭過濾,進行GC-MS分析。取牛樟芝多糖水解物按上述方法進行糖腈乙酸酯衍生化和GC-MS分析[15]。

1.2.3.2 GC-MS檢測條件 Agilent DB-WAX毛細管柱(30 m×0.250 mm,0.25 μm);載氣:高純氦;體積流量:0.8 mL/min;分流比:20∶1;進樣口溫度220 ℃;程序升溫:起始溫度100 ℃,10 ℃/min升至150 ℃,保持1 min;5 ℃/min升至160 ℃,保持1 min;1 ℃/min升至170 ℃,保持1 min;2 ℃/min升至180 ℃,保持1 min;1 ℃/min升至185 ℃,保持1 min;10 ℃/min升至220 ℃,保持5 min;離子源溫度230 ℃,前進樣口溫度250 ℃,掃描質量范圍m/z 50～500 amu。

1.2.3.3 方法學考察 精密度:將標準單糖混合溶液進行衍生化后連續進樣6次,計算各單糖包括鼠李糖、阿拉伯糖、巖藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖峰面積RSD值。

重復性:牛樟芝多糖平行六份進行水解和衍生化后GC-MS測定,計算各單糖含量的RSD值。

穩定性:牛樟芝多糖經水解衍生化后于2、4、6、8、10、12、24 h分別進樣,計算半乳糖、葡萄糖、甘露糖峰面積的RSD值。

1.2.3.4 多糖的單糖組成 按下列公式計算多糖中單糖質量,并求得相應單糖的摩爾數。

f=mrAs/msArm0=f(A0×ms)/As

式中,m0、mr、ms分別表示待測單糖、單糖標準品和內標物質的質量;A0、Ar、As分別表示待測單糖、單糖標準品和內標物質的峰面積;f表示相對校正因子。

1.2.4 多糖體外抗氧化活性評價

1.2.4.1 DPPH自由基清除活性 分別取濃度為0.1、0.2、0.4、0.8、1 mg/mL的牛樟芝粗多糖溶液1 mL,加入0.05 mg/mL的DPPH溶液1 mL,混勻,避光反應30 min,以甲醇代替DPPH溶液作樣品對照,以甲醇代替樣品做空白組,以不同濃度(0.1、0.2、0.4、0.8、1 mg/mL)的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)作為陽性對照組,采用分光光度比色法在517 nm處測定吸光度,對DPPH的清除率以下列公式計算[16]:

DPPH自由基清除率(%)=[A0-(A1-A2)]×100/A0

式中,A0為空白吸光度值,A1為樣品吸光度值,A2為樣品對照吸光度值。

1.2.4.2 ABTS自由基清除活性 取7 mmol的ABTS和2.45 mmol過硫化鉀等體積混合,室溫下置于暗處放置12～16 h,得到ABTS儲備液,使用前將儲備液用蒸餾水稀釋40～45倍,使該溶液在734 nm下的吸光度值在0.7±0.02。分別取不同濃度(0.5、1、2、3、4 mg/mL)的供試品溶液0.1 mL加入3.9 mL的ABTS溶液,搖勻,室溫下放置6 min后再734 nm處測定吸光度。以不同濃度(0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL)的BHT作陽性對照,以蒸餾水代替樣品做空白對照。對ABTS的清除率以下列公式計算[17]:

ABTS自由基清除率(%)=[A0-(A1-A2)]×100/A0

式中,A0為空白吸光度值,A1為樣品吸光度值,A2為樣品對照吸光度值。

1.2.4.3 OH自由基清除活性 取不同濃度(0.25、0.5、1、2、4 mg/mL)的供試品溶液1 mL,依次加入1.5 mmoL/L的硫酸亞鐵1 mL,20 mmoL/L的水楊酸鈉0.3 mL,6 mmoL/L的過氧化氫0.7 mL,搖勻,37 ℃水浴30 min,于510 nm處測定吸光度,以水代替樣品作空白對照,以水代替水楊酸鈉作樣品對照,以不同濃度(0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL)的VC作陽性對照,對羥基自由基的清除率以下列公式計算[18]:

OH自由基清除率(%)=[A0-(A1-A2)]×100/A0

式中,A0為空白吸光度值,A1為樣品吸光度值,A2為樣品對照吸光度值。

1.3 數據處理

實驗平行做三次,實驗數值均以均值±標準差表示,并采用SPSS 21.0軟件計算IC50值。

2 結果與分析

2.1 粗多糖總糖含量測定

2.1.1 線性關系考察 以葡萄糖濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制標準曲線,得線性回歸方程:Y=0.06406X+0.00162,r=0.9998。結果表明,無水葡萄糖在濃度為1.46～14.57 μg/mL內線性關系良好。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Glucose standard curve

2.1.2 方法學考察及多糖樣品測定結果 精密度實驗結果顯示葡萄糖對照品的吸光度RSD值為2.39%,說明該儀器精密度良好;重復性實驗結果顯示供試品總糖含量的RSD值為2.71%,說明該方法重復性良好;穩定性結果顯示該方法在2 h內穩定,RSD值為0.7%;回收率實驗結果顯示加樣回收率范圍95.51%～102.16%,RSD為2.87%。牛樟芝多糖的得率為3.02%,粗多糖中的總糖含量為55.42%±2.13%。

2.2 多糖單糖組成

2.2.1 方法學考察 精密度實驗結果顯示鼠李糖、阿拉伯糖、巖藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖峰面積的RSD值分別為1.38%、0.88%、1.35%、1.29%、1.41%、1.76%,表明儀器精密度良好;重復性實驗結果顯示半乳糖、葡萄糖、甘露糖含量的RSD值分別為2.2%,3.08%,2.89%,表明該方法重復性良好;穩定性結果顯示該方法在24 h內穩定,半乳糖、葡萄糖、甘露糖峰面積RSD值分別為2.38%,1.98%,2.73%,表明各單糖衍生物穩定性良好。

2.2.2 牛樟芝多糖的單糖組成 多糖的單糖組成分析是控制多糖質量標準和提供多糖基本信息的最重要環節,多糖生物活性與其單糖組成及比例等密切相關。本研究首次采用GC-MS分析鑒定了牛樟芝多糖的單糖組成,采用鹽酸羥胺肟化和乙酸酐乙酰化衍生法有效克服由于糖的異構化而造成的多峰現象,每種單糖都能獲得單一的色譜峰,有利于進行氣相色譜的定性和定量分析;牛樟芝多糖經三氟乙酸水解,糖腈乙酸酯衍生化后,進行GC-MS檢測。通過比較圖2和圖3,得知牛樟芝多糖主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖三種單糖組成。其中,葡萄糖含量最大,甘露糖和半乳糖次之,三種單糖的摩爾比為1∶7.14∶0.96。Su等[12]采用PMP衍生化HPLC法測得牛樟芝中含有六種單糖,主要單糖組成為葡萄糖、甘露糖、鼠李糖,摩爾百分比分別為84%、7.2%、2.9%,以葡萄糖含量最高。龔勁松等[19]的實驗結果表明多糖的不同提取方法也會影響到單糖的含量分布,不同種類產地的蟲草測得其單糖含量差異明顯[20]。由此可見,多糖的單糖組成的檢測結果可能與樣品的來源、多糖的提取分離、衍生化和檢測方法有關。

圖2 對照品單糖和內標物混合樣品的總離子流圖Fig.2 Total ion current profile of the mixed samples of each standard monosaccharide and internal standard注:1～7分別為鼠李糖、阿拉伯糖、巖藻糖、 核糖醇、半乳糖、葡萄糖、甘露糖。

圖3 牛樟芝多糖水解物及內標物的總離子流圖Fig.3 Total ion current profile of the hydrolysate of the polysaccharide from Antrodia cinnamomea, as well as the internal standard注:1～4分別為核糖醇、半乳糖、葡萄糖、甘露糖。

2.3 多糖的抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除活性 不同濃度的牛樟芝多糖對DPPH自由基的清除能力測定結果見圖4。由圖4可知,牛樟芝多糖對DPPH自由基的清除作用與濃度呈正相關,隨著濃度的增加清除作用加強,當多糖濃度為1 mg/mL,清除率達到70.62%,多糖對DPPH自由基清除的IC50值為(0.584±0.008) mg/mL,陽性對照BHT的IC50值為(0.283±0.002) mg/mL。Wang等[21]對不同培養方式的牛樟芝的冷水浸提物、甲醇提取物、熱水提取物進行體外DPPH自由基清除實驗,三者均具一定清除自由基活性,呈明顯的劑量依懶性,且與牛樟芝的培養方式和提取方法有關。因此,不同的樣品來源和提取方式均可影響牛樟芝提取物的DPPH自由基清除活性。本研究證實牛樟芝多糖具有良好的DPPH自由基清除活性。

圖4 牛樟芝多糖及BHT對DPPH自由基的清除率Fig.4 Scavenging rate of DPPH free radicals by the polysaccharide from Antrodia cinnamomea and BHT

2.3.2 ABTS自由基清除活性 不同濃度的牛樟芝多糖對ABTS自由基的清除能力測定結果見圖5。由圖5可知,隨著牛樟芝多糖增大,對ABTS自由基的清除作用加強,在濃度為4 mg/mL時,清除率高達98.52%,多糖清除ABTS自由基的IC50為(1.182±0.058) mg/mL,陽性對照BHT的IC50為(0.098±0.001) mg/mL。體外抗氧化研究表明不同產地的靈芝多糖ABTS自由基清除的IC50值分別為1.50～3.50 mg/mL[22]。由此可見,牛樟芝多糖對ABTS自由基具有一定的清除作用,其活性要高于靈芝多糖。

圖5 牛樟芝多糖及BHT對ABTS自由基的清除率Fig.5 Scavenging rate of ABTS free radicals by the polysaccharide from Antrodia cinnamomea and BHT

2.3.3 OH自由基清除活性 不同濃度的牛樟芝多糖對ABTS自由基的清除能力測定結果見圖6,由圖6可知,牛樟芝多糖對OH自由基具有一定清除作用,且清除能力隨多糖濃度增加而增大,多糖對OH自由基清除的IC50為(1.384±0.133) mg/mL,陽性對照VC清除OH自由基的IC50為(0.774±0.004) mg/mL。因此,牛樟芝多糖對OH自由基也具有較好的清除活性。已有的研究表明采用水提醇沉和膜提取工藝得到的靈芝多糖對OH自由基清除的IC50分別為1.58和1.36 mg/mL[23]。由此可見,牛樟芝多糖和靈芝多糖對OH自由基清除作用相近,但均弱于陽性對照VC。

圖6 牛樟芝多糖及VC對OH自由基的清除率Fig.6 Scavenging rate of OH free radicals by the polysaccharide from Antrodia cinnamomea and VC

3 結論

本研究使用苯酚硫酸法測得牛樟芝粗多糖中的總糖含量為55.42%±2.13%。選取核糖醇作為內標物,采用內標法測定多糖的單糖組成,實驗結果表明牛樟芝多糖主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成,摩爾比為1∶7.14∶0.96。體外抗氧化活性結果證實牛樟芝多糖對DPPH自由基、ABTS自由基、OH自由基三種不同自由基具有較好的清除效果,并表現出明顯的量效關系。本研究測定了牛樟芝多糖的含量、單糖組成以及體外抗氧化活性,為牛樟芝的質量控制提供一定的參考依據。