異常威克漢姆酵母Y55固定化條件優化及對其釀酒過程的影響

史雁飛,閆鳳翔,張澤錕,杜小威,王小勇,張秀紅,*

(1.山西師范大學生命科學學院,山西臨汾 041004; 2.山西師范大學現代文理學院,山西臨汾 041004; 3.山西杏花村汾酒廠股份有限公司,山西汾陽 032205)

清香白酒作為我國歷史悠久的酒精飲料之一,以一種特殊的文化方式,在我國傳統文化中占據著重要地位。研究發現,適量飲酒可以消除疲勞,增強免疫,加強血液循環等[1]。清香型白酒的主體香氣成分是乙酸乙酯和乳酸乙酯,有研究表明乙酸乙酯的合成途徑有兩種,主要是在酵母醇酰基轉移酶作用下,由乙酰輔酶A與乙醇發生轉酰基作用而成;另一種是酵母在發酵過程中利用葡萄糖先代謝生成乙醇和乙酸,而后在酵母菌產生的酯化酶作用下使乙酸和乙醇結合生成乙酸乙酯[2]。異常威克漢姆酵母為主的產酯酵母對酒精的耐受性較差,乙醇對異常威克漢姆酵母菌生長和發酵性能具有嚴重抑制作用[3-5]。穩定產酯酵母的活性,對于增加乙酸乙酯進而改善基酒的品質具有重要的實踐意義。

細胞固定化技術是利用物理或化學手段將游離的酵母細胞高濃度限定于固定的載體空間區域內,并不斷進行生長繁殖,從而保持活性提高細胞抗逆性并可以反復利用的方法[6-7]。固定化細胞的方法有多種,其中包埋法具有操作簡單,對微生物細胞活性影響小等優點,被廣泛應用于目前微生物細胞固定化技術中。海藻酸鈉作為一種天然高分子多糖,具有無毒害作用,廉價易得等優點,是包埋固定酵母細胞中常用的載體之一。固定化載體對酵母細胞形成保護作用,使具有生長快、反應迅速、可連續使用等優點,越來越廣泛的應用于食品發酵工業中[8-10]。

本研究擬以海藻酸鈉為固定化載體,氯化鈣為輔助劑,在不同條件下固定產酯酵母細胞,探究海藻酸鈉濃度等因素對固定化酵母發酵特性的影響,分析固定化酵母于與游離酵母發酵特性的區別,以及加入固定化產酯酵母的固態發酵釀酒的影響,優化產酯酵母細胞的固定化條件。以期為固定化產酯酵母在清香白酒中的實際應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高粱、大曲 山西省杏花村汾酒廠股份有限公司;異常威克漢姆酵母Y5-5 山西師范大學生命學院生物工程實驗室篩選并保藏;酵母膏、蛋白胨、硫酸銅、乙酸鈉、酚酞、氫氧化鈉、葡萄糖、無水氯化鈣、海藻酸鈉、鹽酸等 均為分析純,天津市光復精細化工研究所。

PH-3C酸度計 上海雷磁有限公司;XPH-3恒溫水浴鍋 上海博訊有限公司;電子萬用爐 上海恒科實業發展有限公司;SPX-250B-D恒溫震蕩培養箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 產酯酵母菌懸液的制備 無菌條件下將酵母菌(W.anomalusY5-5)接種至YPD液體培養基中28 ℃培養至對數期,約12 h,4000 r/min 4 ℃離心10 min,用滅菌的生理鹽水稀釋成1011、1010、109、108和107個/mL濃度,由血球計數法檢測。

1.2.2 固定化酵母細胞的制備 稱取海藻酸鈉用無菌水加熱溶解，配制成一定濃度的海藻酸鈉溶液，降至常溫。按試驗設計取3 mL稀釋好的酵母菌懸液與海藻酸鈉溶液充分混合均勻，配制成總體積為30 mL，菌液為一定濃度的海藻酸鈉酵母菌懸液。無菌條件下用注射器(配有10#注射針頭)將上述海藻酸鈉酵母菌懸液緩慢滴入相應溫度和濃度的氯化鈣溶液中造粒，恒溫維持1 h，使酵母菌充分固定化。棄去上清液，無菌水沖洗固定化酵母3次后，置于0.05 mol/L氯化鈣溶液中24 h后備用[11]。

1.2.3 酵母細胞固定化條件的單因素試驗

1.2.3.1 海藻酸鈉濃度對固定化酵母細胞發酵的影響 固定化輔助材料氯化鈣濃度為2.0 mol/L,固定化溫度為20 ℃,包埋菌液濃度為108個/mL,海藻酸鈉濃度依次設定為2%、3%、4%、5%、6%,制備固定化酵母顆粒分別加入100 mL YPD液體培養基中,28 ℃發酵7 d后,測發酵液殘糖量和顆粒完整率,及串蒸后測樣液的總酯和酒精度。

1.2.3.2 氯化鈣濃度對固定化酵母細胞發酵的影響 固定化酵母包埋劑海藻酸鈉濃度為3%時,固定化溫度為20 ℃,包埋菌液濃度為108個/mL,氯化鈣濃度分別為0.2、0.8、1.4、2.0、2.6 mol/L 5個梯度,制備固定化酵母顆粒分別加入100 mL YPD液體培養基中,28 ℃發酵7 d后,測發酵液殘糖量和顆粒完整率,及串蒸后測樣液的總酯和酒精度。

1.2.3.3 固定化溫度對固定化酵母細胞發酵的影響 取上述最佳的海藻酸鈉濃度3%,氯化鈣濃度2.0 mol/L,包埋菌液濃度為108個/mL,分別在10、20、30、40、50 ℃溫度水平下固定產酯酵母,將制備的固定化酵母顆粒分別加入100 mL YPD液體培養基中,28 ℃發酵7 d后測殘糖量和顆粒完整率,及串蒸測餾出液總酯及酒精度。

1.2.3.4 酵母菌濃度對固定化酵母細胞發酵的影響 設定海藻酸鈉濃度為3%,氯化鈣濃度2.0 mol/L,固定化溫度為20 ℃,包埋固定的產酯酵母濃度分別是106、107、108、109和1010個/mL,將制備的固定化顆粒加入100 mL YPD液體培養基中,28 ℃發酵7 d后測殘糖量和顆粒完整率,及串蒸測餾出液總酯及酒精度。

1.2.4 酵母細胞固定化條件正交試驗 在單因素試驗研究的基礎上,選取海藻酸鈉濃度、氯化鈣濃度、固定溫度、菌液濃度為考察因素,進行L9(34)正交試驗(表1),以殘糖量為指標,來確定最佳固定化條件。

表1 酵母細胞固定化條件正交試驗L9(34)因素水平表Table 1 Level table of factors L9(34) for yeast cell immobilization condition orthogonal test

1.2.5 固定化酵母與游離酵母發酵試驗比較 取稀釋至109個/mL的酵母菌液3 mL制備固定化酵母顆粒,取等體積的游離酵母與固定化酵母顆粒分別置于100 mL YPD液體培養基中,在28 ℃進行發酵7 d后,檢測比較發酵液pH、酒精度、總酸、總酯各指標[12-13]。

1.2.6 固定化產酯酵母固態發酵釀酒試驗 稱取80 g粉碎好的高粱于250 mL發酵裝置中,加80 mL水,蒸熟糊化,補加40 mL水,冷卻至室溫,對照組只加大曲8 g,處理組除了加8 g大曲外,固定化產酯酵母顆粒添加量梯度分別為1%、3%、5%、7%、9%,攪拌均勻,28 ℃封口發酵15 d后,檢測酒醅pH、酒精度、總酸、總酯各指標。另一個釀酒試驗中同樣稱取80 g粉碎好的高粱于250 mL發酵裝置中,加80 mL水,蒸熟糊化,補加40 mL水,冷卻至室溫,對照組只加大曲8 g,處理組大曲與固定化酵母添加總量為8 g,比例分別設定為9∶1、7∶3、5∶5、3∶7、1∶9,28 ℃封口發酵15 d,檢測酒醅pH、酒精度等指標[14]。

1.2.7 指標測定

1.2.7.1 殘糖量的測定 吸取斐林Ⅰ、Ⅱ各5 mL與250 mL三角瓶,加50 mL水搖勻,加熱至沸,用2.5 g/L葡萄糖標準溶液滴定,當溶液藍色即將消失呈紅色時,滴加2滴次甲基藍指示液,繼續滴至藍色消失,記錄消耗葡萄糖標準溶液的體積V[15]。

1.2.7.2 酒精度的測定 準確稱取50 g酒醅,200 mL蒸餾水加入到蒸餾燒瓶中,充分混勻進行蒸餾,取50 mL酒樣于密度瓶中稱重計算酒精度[15]。

1.2.7.3 固定化顆粒機械強度的測量 取100粒固定化顆粒,在相同條件下加入50粒玻璃珠,180 r/min震蕩4 h后計算顆粒完整率,并以顆粒完整率的大小代表機械強度的高低[13]。

完整率(%)=震蕩完成后完整顆粒/100×100

1.2.7.4 總酸和總酯測定 取25 mL酒樣于250 mL具塞錐形瓶中,加2滴酚酞,以0.05 mol/L氫氧化鈉標準溶液來中和,記錄消耗氫氧化鈉標準溶液的體積V。再加25 mL氫氧化鈉標準溶液,搖勻,于沸水浴上冷凝回流0.5 h,取下,冷卻至室溫。用0.1 mol/L鹽酸標準溶液進行反滴定,使微紅色剛好消失為其終點,記錄消耗鹽酸標準溶液的體積V1[16]。試樣中總酸含量計算公式為:

式中:X:測定總酸的含量(以乙酸計),g/L;C:氫氧化鈉濃度,mol/L;V:消耗氫氧化鈉的體積,mL;0.0601:與1.0 mol/L氫氧化鈉標準溶液1 mL反應,與以克表示的乙酸的質量相當;25:取樣體積。

總酯含量計算公式為:

式中:A:測定總酯含量(以乙酸乙酯計),g/L;c:氫氧化鈉標準溶液的濃度,mol/L;25.0:皂化回流時加入0.1 mol/L氫氧化鈉標準溶液的體積,mL;c1:鹽酸標準溶液的濃度,mol/L;V1:反滴定時,消耗0.1 mol/L鹽酸標準溶液的體積,mL;0.088:與1.0 mol/L氫氧化鈉標準溶液1 mL反應,與以克表示的乙酸乙酯的質量相當;25:樣品體積,單位為毫升(mL)。

1.2.7.5 pH的測定 準確稱取酒醅5 g,加入45 mL蒸餾水攪拌均勻,封口靜置30 min后,6層紗布過濾,測定pH。

1.3 數據處理

試驗重復三次,采用SPSS 19.0軟件進行正交試驗及統計學顯著性分析,數據以平均值±標準偏差表示,且p<0.05認為差異顯著,并用Excel進行作圖。

2 結果與分析

2.1 酵母細胞固定化條件的單因素實驗結果

2.1.1 海藻酸鈉濃度對固定化酵母細胞發酵的影響 由圖1知,海藻酸鈉濃度3%時,固定化酵母發酵液的殘糖量最低,酒精度和總酯含量最高,而后隨著海藻酸鈉濃度的增加,發酵液中殘糖量逐漸升高,酒精度和總酯量下降,固定化酵母細胞的強度差異較明顯。表明海藻酸鈉濃度影響著固定化酵母顆粒物質進出,當海藻酸鈉濃度較低時,固定化酵母顆粒的空間網狀結構大，相對滲透能力增強,有利于底物的進入和產物的排出。但酵母細胞易逸出,固定化酵母顆粒珠易碎裂,起不到固定作用[13]。因此海藻酸鈉濃度為3%時,固定化酵母顆粒在發酵特性方面最佳而且機械強度較好。

圖1 海藻酸鈉濃度對固定化酵母細胞發酵過程的影響Fig.1 Effect of sodium alginate concentration on the fermentation process of immobilized yeast注:圖中不同小寫字母表示同一指標各組間差異顯著，圖2～圖6同。

2.1.2 氯化鈣濃度對固定化酵母細胞發酵的影響 從圖2可以看出,隨著氯化鈣濃度的增大,固定化酵母的機械強度增強,氯化鈣濃度為2.0 mol/L的酒精度和總酯含量最高而殘糖量最低,但濃度為2.6 mol/L時Ca2+濃度過大,發酵液殘糖量有所升高,表明Ca2+濃度可以影響固定化酵母的機械強度,從而影響固定化酵母顆粒通透性。濃度過大時,會使固定化酵母顆粒通透性降低,物質進出速率慢,發酵液中的糖分進入固定化顆粒受阻從而影響發酵。所以氯化鈣濃度為2.0 mol/L 時,固定效果最佳。

圖2 氯化鈣濃度對固定化酵母細胞發酵過程的影響Fig.2 Effect of calcium chloride concentration on the fermentation process of immobilized yeast

2.1.3 固定溫度對固定化酵母細胞發酵的影響 從圖3可知,隨著固定溫度的增加,發酵液總酯量及固定化酵母顆粒的機械強度差無顯著的變化(p>0.05),在40 ℃發酵液的殘糖量為3.82 g/L,與20 ℃時的殘糖量有顯著差異(p<0.05),而在20 ℃時發酵液酒精度為3.7%(v/v)和其他溫度的酒精度有顯著差異(p<0.05)。固定化溫度為20 ℃時,發酵液的殘糖量最低,酒精度和總酯量最高,說明此溫度下固定化酵母對營養物質的利用較充分。固定化溫度對固定化酵母細胞的發酵影響較小,但考慮到溫度在固定化酵母顆粒對發酵液糖濃度的代謝方面的作用,故選取20 ℃為較好的固定溫度。

圖3 溫度對固定化酵母細胞發酵過程的影響Fig.3 Effect of temperature on the fermentation process of immobilized yeast

2.1.4 酵母菌菌液濃度對固定化酵母細胞發酵的影響 由圖4知,隨著菌液濃度的增加,發酵液酒精度整體呈現先升高后降低的趨勢,在固定菌液濃度為108個/mL時,發酵液酒精度和總酯產量最高,殘糖量最低,說明此時固定化酵母菌對糖的利用較好,但是與菌液濃度為109個/mL時的總酯產量無顯著差異(p>0.05)。而當菌液濃度為1010個/mL時,殘糖量有所升高,酒精度和總酯量降低,完整率達到83.7%,所以固定化酵母顆粒的機械強度無明顯變化,表明前期酵母菌濃度過大造成其對營養物質的競爭,從而導致后期發酵不足,維持時間不長。因此較佳的酵母菌液濃度為108個/mL。

圖4 酵母菌濃度對固定化酵母細胞發酵過程的影響Fig.4 Effect of yeast concentration on the fermentation process of immobilized yeast

2.2 酵母細胞固定化條件優化

據表2可知,以殘糖量為固定化酵母對發酵液中糖分物質消耗利用的試驗指標,通過極差R值的比較,影響固定化酵母細胞條件的因素依次為A(海藻酸鈉濃度)>B(氯化鈣濃度)>C(菌液濃度)>D(固定化溫度),原因可能與海藻酸鈉包埋形成的小球在與磷酸、乳酸等接觸后會逐步解體[8],而酵母發酵過程中產生酸類物質有一定的聯系,但這為下一步選取海藻酸鈉復合固定材料提供依據。據k1、k2、k3的大小可以得出水平最優的組合是A2B2C3D3即海藻酸鈉濃度為3%,氯化鈣濃度2.0 mol/L,酵母菌液濃度109個/mL,固定化溫度25 ℃。

表2 酵母細胞固定化條件優化正交試驗結果Table 2 Optimization result of immobilization conditions of yeast cells by orthogonal experiment

2.3 驗證實驗

正交設計中最優條件為海藻酸鈉濃度為3%、氯化鈣濃度2.0 mol/L、酵母菌液濃度為109個/mL、固定化溫度25 ℃,該優化條件下固定化酵母細胞液體發酵,進行驗證,3 次平行實驗得殘糖量為(2.75±0.03) g/L,驗證結果小于表2中的1～9組實驗的殘糖量,表明此條件下固定化酵母更好地利用糖類物質進行發酵,因此A2B2C3D3可作為最優工藝。

2.4 固定化產酯酵母與游離產酯酵母發酵性能的比較

由表3可知,在最優條件下固定酵母發酵,固定化產酯酵母發酵液pH、總酸、總酯略高于游離產酯酵母,總酸略低于游離產酯酵母。而且pH和總酸含量固定化酵母與游離酵母沒有顯著性差異(p>0.05),總酯和酒精度差異顯著(p<0.05)。表明固定化載體可以對產酯酵母細胞形成保護作用,使得其發酵性能較優。

表3 固定化酵母與游離酵母發酵性能比較Table 3 Comparison of fermentation performance between immobilized yeast and free yeast

2.5 固定化酵母模擬固態發酵釀酒試驗

由圖5可知,pH、總酸含量較穩定,對照組與處理組沒有顯著的差異;酒精度處理組較對照組有所提高,添加量為9%時最高,但差異性不顯著。總酯含量處理組與對照組差異顯著,添加固定化產酯酵母顆粒的處理組總酯含量最高達3.4 g/L,較對照組提高約1倍左右,而處理組之間無顯著差異。表明海藻酸鈉等固定化材料形成的空間網狀結構在發酵后期酒醅乙醇和總酸增加的條件下,可以對產酯酵母有一定程度地保護作用,從而有效的提高酒醅的酯產量。

圖5 添加量固定化酵母對釀酒過程的影響Fig.5 Effect of immobilized yeast adding on the brewing process of light-flavor Baijiu

由圖6可知,pH、總酸含量、酒精度較穩定,對照組與處理組沒有顯著的差異;總酯含量處理組與對照組差異顯著,添加固定化產酯酵母顆粒的處理組較對照組總酯含量提高約1倍左右,在大曲與固定化酵母添加比為9∶1時總酯含量最高達到了3.38 g/L,而處理組之間無顯著差異。綜合分析表明,應用固定化酵母顆粒于固態發酵釀酒中,可以在不影響酒醅酒精度,pH等指標的前提下,提高總酯的含量,可以有效的提升白酒的風味物質產量。

圖6 大曲與固定化酵母的比例對釀酒過程的影響Fig.6 Effect of the ratio of Daqu and immobilized yeast on the brewing process of light-flavor Baijiu

3 結論

根據單因素及正交試驗結果可知海藻酸鈉和氯化鈣濃度對固定化酵母的機械強度、發酵特性影響較大,固定溫度和包埋菌液濃度影響較小。因此產酯酵母細胞最佳的固定化條件為海藻酸鈉濃度為3%,氯化鈣濃度2.0 mol/L,固定化溫度為25 ℃,包埋酵母菌液濃度109個/mL。在該條件下固定化酵母細胞液體發酵,殘糖量達到(2.75±0.03) g/L,固定化酵母細胞效果最好。通過固定化酵母與游離酵母發酵性能實驗比較,發現固定化酵母細胞相比游離酵母在總酯、酒精度等方面均具有一定的優勢,說明固定化載體的網狀結構可以對酵母細胞起到保護作用。模擬固態發酵釀酒試驗,無論是加入大曲量不變,按比例添加固定化產酯酵母顆粒,還是大曲和固定化酵母以一定比例進行添加,和對照相比酒醅中的酒精度、總酸含量等無顯著性變化,而總酯的含量差異明顯提高約1倍。說明固定化產酯酵母對于提高清香白酒酒質具有重大意義,為進一步的實踐車間生產提供理論依據。