超高壓和熱處理對發酵石榴汁品質的影響

殷曉翠,馬 嫄,*,蘇 凡,梁智林,羅 鳴,付東旭,車振明,袁乙平,耿越昌,徐 娟

(1.西華大學食品與生物工程學院,四川成都 610039; (2.四川福能源生物科技有限公司,四川成都 610031)

石榴(PunicagranatumL)屬于安石榴科,廣泛分布于亞洲、非洲、美洲和歐洲南部的溫帶和亞熱帶地區[1]。石榴富含多酚類、黃酮、鞣質、花色苷等營養物質,這些物質使石榴具有抗氧化和預防癌癥等多種保健作用[2-6]。石榴汁是其主要的加工產品,以石榴汁為原料添加益生菌進行發酵,可以增加石榴汁的營養價值和感官品質,同時有效地保持其功能性成分,是石榴深加工的一條新型途徑,有著巨大的市場潛力[7-9]。

采用合適的殺菌技術以保證產品安全和保持產品品質,是發酵石榴汁加工需要解決的重要問題。目前,果蔬汁的殺菌多采用傳統的熱殺菌方式,但較高的處理溫度在殺滅微生物和酶的同時,也造成營養物質的損失,影響產品質量[10-11],如石榴汁褐變度的提高和花色苷含量的下降[11]。超高壓技術(High hydrostatic pressure processing,HHP)是一種重要的非熱加工技術,是指將密封于彈性容器內的食品置于水或其他液體作為傳壓介質的壓力系統中,經100～1000 MPa壓力處理,在常溫甚至更低的溫度下,達到殺菌、滅酶,保證食品安全并延長貨架期等作用[12-13]。超高壓技術只作用于非共價鍵,與傳統熱殺菌相比,在殺菌的同時能夠更好地保持食品的營養價值[14]。目前,超高壓已應用于多種果蔬汁的加工中,如草莓汁[15]、藍莓汁[16]、桑葚汁[17]、石榴汁[18];超高壓用于石榴汁加工的研究較少,在發酵石榴汁加工中的應用未見報道,分析其貯藏期內品質變化的報道也不多。

本研究通過比較超高壓和熱處理(Thermal processing,TP)兩種殺菌方式對發酵石榴汁品質的影響,探究發酵石榴汁在4 ℃貯藏過程中的品質變化規律,探討超高壓技術在石榴汁生產中應用的可行性,為超高壓技術在石榴汁產業化加工中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甜石榴濃縮汁(TSS 64.8 °Brix)、酸石榴濃縮汁(TSS 62.3 °Brix)、桑葚濃縮汁(TSS 62.7 °Brix) 四川福能源生物科技有限公司提供;植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌(活菌數≥1.0×1010CFU/g) 四川高福記生物科技有限公司;葡萄酒果酒專用酵母(活菌數≥1.0×109CFU/g) 安琪酵母股份有限公司;白砂糖 成都新紀元食品有限公司;甲醇、沒食子酸、蘆丁、福林酚等試劑(分析純) 成都科龍化工試劑公司;平板計數培養基、孟加拉紅培養基 北京奧博星生物技術有限責任公司;Trolox(≥98.0%)、1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)(≥97.0%) 上海源葉生物科技有限公司。

UV-2600型紫外可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;G154DWS型高溫滅菌鍋 上海賽海洋生物科技實業有限公司;A610型全自動折光儀 濟南海能股份有限公司;PHS-320型pH計 成都世紀方舟科技有限公司;HPP-5L超高壓滅菌設備 包頭科發高壓科技有限責任公司;單室真空包裝機 諸城市興和機械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵石榴汁的制備

操作要點:甜石榴濃縮汁與飲用水按照1∶3.6875的質量比進行復原后,65 ℃下巴氏滅菌20 min,裝入經121 ℃、20 min高溫滅菌的發酵罐。加入12%質量分數為50%的白砂糖糖液,接種1.5%的嗜酸乳桿菌、1.5%植物乳桿菌和0.02%的酵母菌(以復原石榴汁和糖液的總質量計),將發酵罐置于暗處,25 ℃避光發酵48 h。添加酸石榴濃縮汁(100 mL/L)和桑葚濃縮汁(1.11 mL/L),進行口味調配,將調配好的發酵石榴汁分裝到聚乙烯袋中,40 mL/袋,采用真空包裝機進行封口,暫存于濕度為85%～90% 的4 ℃冷庫(不超過2 h),準備殺菌處理。

1.2.2 發酵石榴汁滅菌處理

1.2.2.1 超高壓處理 將分裝好的樣品置于超高壓設備中,于室溫下進行超高壓處理,經過前期預實驗,選用600 MPa/10 min為超高壓處理條件,并進行殺菌處理。

1.2.2.2 熱處理 經過前期預實驗,發現在65 ℃處理20 min,可使殺菌效果達到行業標準的要求,保證產品安全且不出現蒸煮味,因此選用65 ℃/20 min為熱處理殺菌條件,并進行殺菌處理。

將經過超高壓和熱處理的樣品置于4 ℃冷庫中貯藏30 d,每5 d取樣測定貯藏期內品質的變化。

1.2.3 指標測定

1.2.3.1 微生物的測定 菌落總數參照GB 4789.2-2016[19]進行測定;霉菌和酵母菌參照GB 4789.15-2016[20]進行測定。

1.2.3.2 pH的測定 采用pH計測定發酵石榴汁的pH。

1.2.3.3 可溶性固形物(TSS)的測定 參照Zou等[17]的方法,使用阿貝折射儀測定,以蒸餾水作為空白,結果以°Brix計。

1.2.3.4 可滴定酸(TA)的測定 參照Varela-Santos等[6]的方法,采用pH電位法測定可滴定酸,模式選擇pH8.1。量取10 mL樣品,用0.1 mol/L NaOH溶液進行滴定。

1.2.3.5 色澤的測定 采用全自動色差儀在反射模式下對發酵石榴汁的亮度(L*)、紅色值(a*)和黃色值(b*)進行測定,根據公式計算總色差(ΔE)。

式(1)

1.2.3.6 總酚含量的測定 參照Di Cagno等[21]的方法,采用Folin-Ciocalteau法測定總酚含量,并略作修改。樣品測定:取1 mL稀釋樣品與0.5 mL Folin-Ciocalteau試劑混合,加入6.5 mL 10% Na2CO3溶液,在室溫下置于暗處保持1 h,用分光光度計測量760 nm處的吸光值。總酚含量以每100 mL樣品中含有的沒食子酸的毫克數表示。

標準曲線的制作參照古小露等[22]的方法:精密量取 0.05 mg/mL 的沒食子酸標準溶液0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL,分別置于25 mL 容量瓶中,各加入1.0 mL福林酚試劑和13 mL 10%的Na2CO3溶液,用蒸餾水定容,混勻,室溫避光靜置60 min,在760 nm處測定其吸光度,以沒食子酸溶液濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標,制作標準曲線,其回歸曲線方程為Y=57.928X+0.0207(R2=0.999)。

1.2.3.7 花色苷含量的測定 參照Chen等[23]的方法,采用pH示差法測定總花色苷含量,并略作修改。樣品測定:取0.5 mL待測定樣品溶液,分別用4.5 mL pH1.0(0.025 mol/L 的KCl)和4.5 mL pH4.5的(0.4 mol/L醋酸鈉)緩沖液稀釋,混勻后,室溫避光靜置15 min,以蒸餾水作為對照,分別測定其在510、700 nm下的吸光值。花色苷含量C(mg/L)的計算公式如下。

吸光值A=(A510-A700)pH1.0-(A510-A700)pH4.5

式(2)

式中:Mw:以矢車菊素-3-葡萄糖苷為標準,為449.2;ε:26900;DF:樣品稀釋倍數。

1.2.3.8 總黃酮含量的測定 參照Wang等[24]的方法,測定總黃酮含量。標準曲線的制作:精確量取0.5 mg/mL蘆丁標準溶液0.25、0.30、0.40、0.50、0.60 mL于5 mL容量瓶中,加入2 mL蒸餾水,加入0.15 mL 5% NaNO2溶液,反應6 min后,加入0.15 mL 10%的AlCl3·6H2O溶液,5 min后加入1 mL 1 mol/L NaOH溶液,用蒸餾水補至為5 mL,將上述溶液混勻后,室溫避光靜置30 min,在510 nm處測定吸光值。以蘆丁溶液濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標制作標準曲線,其回歸曲線方程為:Y=2.2037X+0.0005(R2=0.999)。

樣品測定:取0.5 mL稀釋10倍的樣品,于5 mL容量瓶中,按照上述方法,測出吸光度,并根據標準曲線計算相應總黃酮的含量。

1.2.3.9 抗氧化活性的測定 參照古小露等[22]的方法,并略作修改。標準曲線的制作:配制濃度為20～160 μmol/L的 Trolox標準溶液。分別取1 mL 標準溶液與 4.5 mL 100 μmol/L的DPPH甲醇溶液(準確稱取7.856 mg DPPH,用甲醇定容至200 mL)充分混合,室溫避光放置30 min,于517 nm處測定吸光度(A實驗)。對照組用4.5 mL 無水甲醇代替DPPH溶液(A對照),空白組用1 mL 蒸餾水代替樣品(A空白),各組平行測定3次,按式(3)計算Trolox 對DPPH自由基清除率。以Trolox 質量濃度為橫坐標,DPPH自由基清除率為縱坐標,繪制標準曲線。

式(3)

樣品的測定:取1 mL發酵石榴汁按上述方法測定其中的DPPH自由基清除率,抗氧化能力以總酚含量以Trolox當量(TEAC)μmol/L計。

1.3 數據處理

所有實驗均重復3次,結果以Mean±SD表示,圖片及表格利用SPSS 23.0和Origin Pro 8.6軟件進行繪制,不同處理方法間的數據采用Ducan比較方法,顯著水平為0.05,并用標記字母法進行標記。采用SPSS進行Person相關系數分析。

2 結果與分析

2.1 超高壓和熱殺菌處理后微生物數量的變化

表1為超高壓和熱處理對發酵石榴汁的殺菌效果,圖1為殺菌處理后發酵石榴汁貯藏期間菌落總數的變化。如表1所示,未處理的發酵石榴汁菌落總數為1.45×104CFU/mL,經過超高壓和熱處理后,菌落總數符合《NY/T 434-2016 綠色食品、果蔬汁飲料》[25]對菌落總數≤100 CFU/mL的要求。經過超高壓和熱處理后,發酵石榴汁中的霉菌和酵母均未檢出。由圖1可知,在貯藏期內,隨著貯藏時間的延長,兩種處理組中的菌落總數呈現明顯上升趨勢,且熱處理組的增長速度高于超高壓處理組。在30 d時,超高壓處理組和熱處理組菌落總數分別為55、80 CFU/mL,均低于100 CFU/mL,說明在4 ℃條件下,貯藏時間在30 d內,超高壓和熱處理均能保持發酵石榴汁安全貯藏。兩個處理組發酵石榴汁的菌落總數在貯藏期內增加,可能源于處理后殘存微生物在貯藏期內的繁殖,而超高壓處理組菌落總數的提高還可能源于超高壓引起的亞致死微生物在貯藏期內的復蘇及繁殖[26]。Munoz等[27]研究發現,超高壓處理可使接種到橙汁、蘋果汁和蔬菜湯中的E.coli出現亞致死現象。

表1 超高壓和熱處理對發酵石榴汁的殺菌效果Table 1 The sterilization effect of fermented pomegranate juice treated by HHP and TP

圖1 貯藏期間發酵石榴汁菌落總數的變化Fig.1 Changes of TAB of fermented pomegranate juice during storage

2.2 超高壓和熱殺菌處理對發酵石榴汁pH、TA和TSS的影響

如表2～表3所示,未處理的發酵石榴汁pH、TA、TSS分別為3.28±0.00、3.64%±0.10%、(21.48±0.00)°Brix。超高壓和熱處理后,發酵石榴汁的TSS、pH和TA均無顯著變化(p>0.05),說明處理方式對發酵石榴汁系統的穩定性影響不顯著(p>0.05)。趙鳳等[26]研究也發現,超高壓和熱處理后枸杞汁的TSS、pH和TA無顯著性變化(p>0.05),與本文結果一致。在貯藏期間,兩種處理的發酵石榴汁的TSS、pH無顯著變化(p>0.05),而TA顯著下降(p<0.05),這可能是由于貯藏期間,少量微生物代謝產酸和α-羥基酸的鏈降解反應引起的[23]。

表2 超高壓和熱處理對發酵石榴汁色澤、pH、TSS、TA、總酚、總黃酮、花色苷和抗氧化活性的影響(n=3)Table 2 Effects of HHP and TP on the color,pH,TSS,TA,total phenols,total flavonoids, total anthocyanins and antioxidant activity in fermented pomegranate juice(n=3)

表3 貯藏期間發酵石榴汁的pH、TSS和TA的變化(n=3)Table 3 pH、TSS、TA variation of fermented pomegranate juice during storage(n=3)

2.3 超高壓和熱殺菌處理對發酵石榴汁活性成分的影響

2.3.1 總酚含量的變化 總酚是石榴汁中重要的功能性成分。由表2可知,未處理發酵石榴汁中的總酚含量為90.33 mg/100 mL,經超高壓處理后其含量顯著增加(p<0.05),而熱處理則顯著降低了發酵石榴汁中的總酚含量(p<0.05)。這與Chen等[23]的研究結果一致。Wang等[24]也研究發現,超高壓處理后的桑葚汁中總酚含量高于熱處理組。由于酚類物質是熱敏性成分,高溫可能使之發生降解;而超高壓不破壞分子內部共價鍵,因此超高壓對酚類物質的影響相對較小[26]。超高壓處理的樣品中總酚含量的增加可能是因為加壓條件下植物細胞被破壞,某些抗氧化成分的可提取性增加[28]。圖2為貯藏期間發酵石榴汁中總酚含量的變化。由圖2可知,在貯藏期間,兩種處理組樣品的總酚含量均呈下降趨勢,貯藏期結束時,超高壓處理組總酚含量降低了26.01%,而熱處理組的總酚含量降低了27.30%,這與Keenan等[29]發現在貯藏期間超高壓處理后的果昔中總酚含量高于熱處理組的結果一致。酚類物質屬于抗氧化成分,其含量在貯藏期間的下降可能是由于樣品中的溶解氧所致,這些氧氣在貯藏期間通過形成氧自由基,從而使酚類物質發生氧化,并最終使其降解[26]。

圖2 貯藏期間發酵石榴汁中總酚含量的變化Fig.2 Changes of total phenols content of fermented pomegranate juice during storage

2.3.2 總花色苷含量的變化 花色苷是石榴汁中重要的呈色物質和功能性成分,大部分以單體形式存在,主要有矢車菊素-3-葡萄糖苷(Cy-3-glu)、天竺葵素-3-葡萄糖苷(Pg-3-glu)和矢車菊素-3-蕓香苷(Pg-3-rut)等3種[30]。由表2可知,未處理發酵石榴汁中的花色苷含量為41.30 mg/L,超高壓和熱處理使發酵石榴汁中的總花色苷含量顯著降低(p<0.05),超高壓處理組的總花色苷損失量低于熱處理組。Patras等[31]研究發現,超高壓處理的藍莓汁和草莓汁中的花色苷含量高于熱處理組。圖3為貯藏期間發酵石榴汁中總花色苷含量的變化。由圖3可知,在貯藏期間,兩種處理組的發酵石榴汁中總花色苷含量均呈現下降趨勢,與總酚的變化趨勢一致。貯藏30 d時,超高壓處理組總花色苷減少了40.89%,熱處理組總花色苷含量降低了44.27%。這表明超高壓處理能更大限度地保留發酵石榴汁中總花色苷的含量。Gao等[32]研究也發現,在貯藏期間超高壓處理組草莓汁的花色苷含量下降程度低于熱處理組,與本文結果一致。

圖3 貯藏期間發酵石榴汁花色苷含量的變化Fig.3 Changes of anthocyanins content of fermented pomegranate juice during storage

2.3.3 總黃酮含量的變化 由表2可知,未處理發酵石榴汁中的總黃酮含量為87.79 mg/100 mL,經超高壓處理后其總黃酮含量未發生顯著變化(p>0.05),而熱處理的發酵石榴汁中的總黃酮含量顯著降低(p<0.05)。Wang等[24]也研究發現,超高壓桑葚汁中的總黃酮含量高于熱處理組。這是由于熱處理造成酚類物質降解,從而降低了其總黃酮的含量。圖4為貯藏期間發酵石榴汁中總黃酮含量的變化。

由圖4可知,在整個貯藏期間,2種處理組的總黃酮含量均呈下降趨勢,與總酚和花色苷的變化趨勢一致。在貯藏前20 d,超高壓處理樣品的總黃酮含量高于熱處理組,此后,熱處理組的總黃酮含量高于超高壓處理組,表明隨著貯藏期的延長,熱處理能更有效控制總黃酮在貯藏期內的損失。Uckoo等[33]研究發現,在貯藏期間熱處理能更好地保留葡萄柚汁中的黃酮類物質含量。

圖4 貯藏期間發酵石榴汁中總黃酮含量的變化Fig.4 Changes of total flavonoids content of fermented pomegranate juice during storage

2.3.4 抗氧化活性的變化 本研究選用了DPPH自由基清除能力的方法來評價超高壓和熱處理前、后及貯藏期間發酵石榴汁的抗氧化活性變化。從表2可以看出,HHP處理對發酵石榴汁的DPPH自由基清除能力無顯著影響(p>0.05),而熱處理顯著降低了其DPPH自由基清除能力(p<0.05),表明超高壓處理對發酵石榴汁中抗氧化活性的保留率高于熱處理組。Dede等[34]研究發現,超高壓番茄汁和胡蘿卜汁中的抗氧化活性高于熱處理組。圖5為貯藏期間發酵石榴汁抗氧化活性的變化。由圖5可知,在貯藏期間兩種處理組的發酵石榴汁中的抗氧化活性均表現出下降的趨勢,與總酚、總黃酮及總花色苷的含量變化趨勢一致。在貯藏期結束時,超高壓處理組石榴汁的抗氧化活性降低了8.47%,而熱處理組的抗氧化活性降低了8.72%,表明超高壓處理能更好地保持發酵石榴汁在貯藏期內的抗氧化活性。Chen等[23]的研究表明,在貯藏期間超高壓處理的石榴汁的抗氧化活性高于熱處理組,與本文結果一致。

圖5 貯藏期間發酵石榴汁中抗氧化活性的變化Fig.5 Changes of antioxidant activity of fermented pomegranate juice during storage

由于石榴汁中的總酚、總黃酮和總花色苷含量與其抗氧化活性有關,因此本研究還對發酵石榴汁的抗氧化活性進行分析,以探究發酵石榴汁中的總酚、總黃酮和總花色苷與抗氧化活性之間的關系。通過相關性分析研究發酵石榴汁中總酚、總黃酮和總花色苷含量與抗氧化活性之間的關系,結果見表4。由表4可知,在貯藏期間發酵石榴汁的抗氧化活性與總酚、總花色苷和總黃酮含量呈現極顯著正相關(p<0.01),表明總酚、總花色苷和總黃酮含量對其貯藏期間的抗氧化活性具有重要貢獻,該研究結論與Kalt[35]和Cao[36]的研究結果一致。Kalt等[35]研究發現,鮮草莓、藍莓和覆盆子在貯藏期間的抗氧化活性與總酚和總花色苷的含量呈極顯著正相關(p<0.01)。Cao等[36]也發現,超高壓草莓汁在貯藏期間的抗氧化活性與總酚和花色苷的含量極顯著正相關(p<0.01),也與本文結果一致。

表4 貯藏期間超高壓和熱處理發酵石榴汁中總酚、黃酮和花色苷含量與抗氧化活性之間的Pearson相關性分析Table 4 Pearson correlation analysis between antioxidant compounds and antioxidant capacity in fermented pomegranate juice after HHP and TP treatments during storage

2.4 超高壓和熱殺菌對發酵石榴汁色澤的影響

果蔬汁的色澤是評價產品品質的重要指標。由表2可知,熱處理和超高壓處理組的ΔE值均低于2,表明兩種處理對發酵石榴汁的色澤影響小,未造成視覺差別。該研究結果與Patras等[31]的研究結果一致。由圖6(A)、(B)、(C)可知,在貯藏期間兩種處理組的L*值和a*值均表現下降的趨勢,表明隨著貯藏時間的延長,發酵石榴汁的亮度降低,紅色變淺,而b*值呈上升的趨勢,說明隨著貯藏時間的延長,發酵石榴汁的顏色向更黃轉變,且熱處理組的L*值和b*值的變化程度高于超高壓處理組,表明其在貯藏期間的色澤變化更劇烈。超高壓和熱處理發酵石榴汁在貯藏期間的色澤變化可能與發酵石榴汁中的花色苷含量下降有關[23]。

圖6 貯藏期間發酵石榴汁L*、a*、b*的變化Fig.6 Changes of L*,a* and b* of fermented pomegranate juice during storage

3 結論

超高壓和熱處理后,發酵石榴汁的微生物數量均符合行業標準,且在貯藏期間呈現上升趨勢,在貯藏結束時,超高壓和熱處理處理組的菌落總數分別為55、80 CFU/mL,也符合行業標準要求;pH、TA和TSS在兩種處理前、后均無顯著變化(p>0.05);在貯藏期內pH、TSS無顯著變化(p>0.05),而TA顯著下降(p<0.05);超高壓處理后的樣品具有更高的總酚、總花色苷、總黃酮和抗氧化活性;在貯藏過程中,總酚、花色苷、總黃酮含量和抗氧化活性均呈下降趨勢,與熱處理相比,超高壓能更好地保留總酚、總花色苷含量及抗氧化活性,而熱處理能更有效地控制貯藏過程中總黃酮的損失;通過相關性分析發現,樣品在貯藏期間的抗氧化活性與總酚、總花色苷和總黃酮含量呈極顯著正相關(p<0.01);與未處理組相比,超高壓和熱處理對發酵石榴汁色澤的影響較小(ΔE<2),在貯藏期間兩種處理組的L*值、a*值呈下降趨勢,b*值呈上升趨勢,且熱處理組的變化程度高于超高壓處理組。

綜上所述,與熱處理相比,超高壓處理組的發酵石榴汁的總酚、總黃酮、總花色苷和抗氧化性等品質更佳,因此在石榴汁的生產加工過程中可以采用超高壓處理或超高壓協同熱處理,以達到滅菌和保質的目的。