紫菜多糖抑制哮喘大鼠模型NF-κB 信號(hào)通路

劉 璟， 李智紅， 胡 玲

（重慶三峽醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校， 重慶404120）

NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子及其抑制物I-κB 共同構(gòu)成的NF-κB 信號(hào)通路, 普遍存在于哺乳動(dòng)物各種細(xì)胞中。 研究表明, NFκB 信號(hào)通路被激活后, 可通過(guò)調(diào)節(jié)樹(shù)突細(xì)胞的表型表達(dá)[1]來(lái)干預(yù)T/B 細(xì)胞活化、 分化[2], 調(diào)節(jié)細(xì)胞因子（如TNFα、 白介素）、 免疫受體、 急性期蛋白等分泌, 在支氣管哮喘的炎癥病程中具有中心調(diào)節(jié)的作用[3-4]。 本實(shí)驗(yàn)以此為切入點(diǎn), 研究紫菜多糖對(duì)哮喘大鼠模型肺組織中NF-κB 信號(hào)通路表達(dá)的作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)健康大鼠30 只, 9 ～10 周齡, 雌雄各半, 體質(zhì)量（200±20） g, 由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供, 動(dòng)物許可證號(hào)SCXK （川） 2013-24。

1.2 試藥 紫菜多糖由西安斯諾特生物技術(shù)有限公司提取, 含有量90%。 TNF-α、 IL-1β、 IL-4、 IL-6 ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)于武漢華美科技有限公司； 兔抗鼠p-NF-κB p50 抗體、 兔抗鼠p-NF-κB p65 抗體、 HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG、 βactin 購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司。

1.3 儀器 輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（德國(guó)徠卡公司）； CX31-LV320數(shù)碼顯微鏡 （日本奧林巴斯公司）； Image Analysis Syste11.0 軟件成像系統(tǒng)； DW-86L286 超低溫冰箱（青島海爾股份有限公司）； BSC-1000ⅡA2 生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）； Multiskan MK3 酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃公司）； DYY-4C 電泳儀（北京六一儀器廠(chǎng)）； Wizard5 掃描儀（上海中晶科技有限公司）； Quantity one 7.0 分析軟件（美國(guó)Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 建模和分組 參考陳一平等報(bào)道[5-6], 第0、 14 天大鼠腹腔注射卵清蛋白, 每只注射量為100 μg, 第21 天開(kāi)始進(jìn)行5%卵清蛋白霧化, 連續(xù)7 d, 每次30 min, 以大鼠呼吸道分泌物涂片鏡檢判定建模成功。 結(jié)果, 成功建立模型大鼠20 只, 10 只作為模型組； 另外10 只腹腔注射紫菜多糖, 給藥量為200 mg/kg, 作為干預(yù)組； 另取10 只健康大鼠作為正常組。 然后, 按預(yù)設(shè)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)考察大鼠癥狀,給藥24 h 后取肺泡灌洗液, 處死后取肺組織進(jìn)行相關(guān)處理。

2.2 評(píng)估標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)大鼠臨床癥狀設(shè)置評(píng)估標(biāo)準(zhǔn), 見(jiàn)表1, 采取疊分制計(jì)算, 無(wú)效分值1～3 分, 緩解分值4～6 分,顯效分值7～9 分。

2.3 細(xì)胞因子檢測(cè) -4 ℃下10 mLPBS 分3 次灌洗大鼠右肺, 收集肺泡灌洗液, 1 500 r/min 離心10 min, 取上清液,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟測(cè)定。

表1 大鼠臨床癥狀評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)

2.4 肺組織病理變化檢查 取大鼠左肺下葉組織, 4%甲醛固定, 24 h 后沖洗, 石蠟包被, 蘇木精-伊紅（HE） 染色, 切4～5 μm 厚薄制片, 光鏡下觀察。

2.5 肺組織NF-κB 表達(dá)檢測(cè) 取大鼠左肺上葉組織50 mg, 勻漿細(xì)胞, 常規(guī)制備組織蛋白裂解液, 提取細(xì)胞總蛋白, 以5%濃縮膠、 10%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE 電泳。 電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上后, 5%脫脂奶粉封閉2 h, 加入兔抗鼠p-NF-κB p50 抗體（1 ∶1 000 稀釋?zhuān)?兔抗鼠p-NF-κB p65 抗體（1 ∶1 000 稀釋?zhuān)? 4 ℃下孵育12 h, TBST 洗滌3 次,加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG （1 ∶2 000 稀釋?zhuān)? 37 ℃下孵育1 h。 顯色用增強(qiáng)發(fā)光顯色系統(tǒng), 條帶用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析, NF-κB 蛋白相對(duì)表達(dá)量以NF-κB/β-actin （灰度值之比） 表示。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 18.0 軟件進(jìn)行處理, 數(shù)據(jù)以s） 表示, 組間比較采用單因素方差分析, 檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05, 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠癥狀 模型組大鼠觀察到進(jìn)食改變, 嗆咳喘息,腹部凹陷, 呼吸節(jié)律不齊、 頻率加快, 精神狂躁, 抓撓口鼻, 嚴(yán)重者有攻擊傾向； 紫菜多糖組大鼠呼吸逐漸平穩(wěn),進(jìn)食和活動(dòng)恢復(fù), 反應(yīng)靈敏。

3.2 肺組織病理變化 圖1 顯示, 模型組大鼠肺組織水腫, 炎細(xì)胞散在浸潤(rùn), 細(xì)小支氣管管壁腫脹增厚, 上皮細(xì)胞明顯受損, 肺泡間距增大； 紫菜多糖組大鼠黏膜基本無(wú)水腫, 有極少散在炎細(xì)胞, 細(xì)小支氣管管壁接近正常組大鼠的組織狀態(tài)。

圖1 各組大鼠肺組織病理變化（HE， ×200）

3.3 NF-κB 表達(dá) 圖2～3、 表2 顯示, 模型組NF-κB p50、NF-κB p65 表達(dá)顯著高于正常組（P＜0.01）； 紫菜多糖組兩者表達(dá)顯著低于模型組（P＜0.01）, 但仍顯著高于正常組（P＜0.05）。

圖2 各組NF-κB p50 蛋白表達(dá)

圖3 各組NF-κB p65 蛋白表達(dá)

表2 紫菜多糖對(duì)NF-κB p50、 p65 蛋白表達(dá)的影響n(yōu)=10）

表2 紫菜多糖對(duì)NF-κB p50、 p65 蛋白表達(dá)的影響n(yōu)=10）

注：與正常組比較,* P ＜0.05,** P ＜0.01；與模型組比較,▲▲P＜0.01

images/BZ_213_1284_1842_2242_1891.png正常組 0.12±0.02 0.14±0.01模型組 1.66±0.93** 1.73±0.89**紫菜多糖組 0.57±0.41*▲▲ 0.54±0.38*▲▲

3.4 炎癥因子水平 表3 顯示, 與正常組比較, 模型組TNF-α、 IL-1β、 IL-4、 IL-6 水平顯著升高（P＜0.01）； 與模型組比較, 紫菜多糖組四者水平顯著降低（P＜0.01）, 但仍顯著高于正常組（P＜0.05）。

表3 紫菜多糖對(duì)TNF-α、 IL-1β、 IL-4、 IL-6 水平的影響 n=10， pg/mL）

表3 紫菜多糖對(duì)TNF-α、 IL-1β、 IL-4、 IL-6 水平的影響 n=10， pg/mL）

注：與正常組比較,*P＜0.05,**P＜0.01；與模型組比較,▲▲P＜0.01

images/BZ_213_236_2472_2244_2522.png正常組 11.98±2.11 78.67±8.23 34.63±5.16 67.87±8.42模型組 105.36±10.87** 181.15±15.89** 145.22±9.42** 163.86±17.63**紫菜多糖組 65.34±6.52*▲▲ 111.77±10.62*▲▲ 54.04±6.77*▲▲ 96.19±10.34*▲▲

4 討論

紫菜多糖在常見(jiàn)食物壇紫菜、 條斑紫菜中含有[7], 具有多種免疫調(diào)節(jié)作用, 謝好貴等[8-9]報(bào)道它可干預(yù)NK 細(xì)胞、 巨噬細(xì)胞功能, 對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié), 從而起到抗腫瘤的作用； 鄧青芳等[10]發(fā)現(xiàn), 它可通過(guò)抗自由基損傷等機(jī)制治療藥物或酒精性肝損傷； 時(shí)超嵐等[11-12]研究顯示, 它通過(guò)TH 細(xì)胞亞群分化和表達(dá)的雙向性免疫調(diào)節(jié),在食物過(guò)敏中發(fā)揮作用, 但尚無(wú)對(duì)其他I 型超敏反應(yīng)的研究。 因此, 本實(shí)驗(yàn)以NF-κB 信號(hào)通路的炎癥調(diào)節(jié)功能為切入點(diǎn), 將紫菜多糖干預(yù)哮喘動(dòng)物模型。

造模后, 大鼠先后出現(xiàn)呼吸頻率急促、 節(jié)律不齊、 用力呼吸、 精神狂躁等呼吸窘迫癥狀, 肺組織有重度炎性滲出和水腫, 細(xì)小支氣管管腔狹窄明顯； NF-κB 表達(dá)較正常組明顯升高, 相關(guān)炎癥因子水平也異常上升, 表明NF-κB信號(hào)通路激活后可升高TNF-α、 IL-1β、 IL-4、 IL-6 等炎癥介質(zhì)表達(dá)與釋放, 導(dǎo)致大量單核-巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞趨化和浸潤(rùn), 免疫細(xì)胞釋放過(guò)量的致炎因子, 加重呼吸道炎癥反應(yīng), 引起炎性損傷, 同時(shí)這些炎癥因子又會(huì)反饋影響NF-κB 信號(hào)激活和表達(dá), 形成惡性循環(huán), 與前期報(bào)道一致[13-19]。 紫菜多糖干預(yù)后, 大鼠呼吸窘迫癥狀逐漸緩解,進(jìn)食量、 活動(dòng)、 精神狀態(tài)基本恢復(fù)正常； 肺組織黏膜水腫基本消失, 細(xì)小支氣管管腔腫脹減輕, 僅見(jiàn)極少炎細(xì)胞浸潤(rùn)； NF-κB p50、 p65 較模型組降低, NF-κB 信號(hào)蛋白表達(dá)亦然； TNF-α、 IL-1β、 IL-4、 IL-6 水平明顯低于模型組,進(jìn)一步證實(shí)該成分通過(guò)影響NF-κB 信號(hào)來(lái)干預(yù)這些相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)。 另外, 結(jié)合病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)紫菜多糖干預(yù)后大鼠肺組織仍有殘余炎癥反應(yīng), 可能與給藥劑量、 時(shí)間有關(guān), 同時(shí)與其他藥物的比較與協(xié)同作用也不明確, 尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述, 紫菜多糖對(duì)哮喘大鼠模型氣道炎癥有明顯緩解作用, 其機(jī)制可能與NF-κB 信號(hào)通路及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)有關(guān)。