60 Co-γ 射線輻照對(duì)黃精中微生物及多糖的影響

黃趙剛， 梁豆豆， 李飛龍， 程 鋼， 葛朝亮

（1. 安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科， 安徽 合肥230022； 2. 安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 安徽 合肥230022）

黃精為百合科植物滇黃精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.、 黃精Polygonatum sibiricum Red. 或多花黃精Polygonatum cyrtonema Hua 的干燥根莖, 具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、 健脾、 潤(rùn)肺、 益腎等功效。 現(xiàn)代藥理研究表明[1-3], 其具有抗衰老、 調(diào)節(jié)免疫、 降血脂、 降血糖、 抗腫瘤、 改善學(xué)習(xí)記憶、 抗骨質(zhì)疏松等作用, 臨床主要用于內(nèi)科疾病, 如痛風(fēng)、高尿酸血癥、 頑固性咳嗽、 糖尿病、 小兒脾疳等, 還可用于男性不育、 婦科疾病, 但其富含多糖類、 氨基酸類成分,故在貯藏過程中易發(fā)生霉變。60Co-γ 射線具有穿透力強(qiáng)、 滅菌效果可靠等特點(diǎn), 能有效殺蟲防霉, 延長(zhǎng)花生、 人參、生姜等藥材的貯藏期[4-6], 但輻照可能導(dǎo)致主要成分含有量變化[7-10]。 因此, 本實(shí)驗(yàn)考察了不同劑量60Co-γ 輻照對(duì)黃精滅菌效果及其多糖含有量的影響。

1 材料

1.1 儀器 SCJ-1311 凈化工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司）；SPX-150B-Z 生化培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）； 2104 電子天平（十萬(wàn)分之一, 上海天平儀器廠）；TU-1810 紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 試藥 黃精購(gòu)自亳州市中藥飲片廠 （批號(hào)1612023521, 產(chǎn)地云南）, 由合肥杰能輻照科技有限公司分別經(jīng)0.5、 1、 3、 6 kGy60Co-γ 射線輻照處理。 D-無(wú)水葡萄糖（110833-201506, 中國(guó)食品藥品檢定研究院）； 蒽酮（20170201, 上海科豐實(shí)業(yè)有限公司）； 蛋白胨（20160517-00）、 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（20160111-00）、 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 （20171129-00）、 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（20171221-00）、 麥康凱液體培養(yǎng)基（20171208-00）、 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（20180122-00） 均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。 所用試劑均為分析純； 水為滅菌注射用水。

2 方法與結(jié)果

2.1 滅菌效果評(píng)價(jià)[11]平皿法測(cè)定樣品中需氧菌總數(shù)、霉菌與酵母菌總數(shù)、 耐熱菌數(shù), 再以大腸埃希菌為控制菌進(jìn)行控制菌檢查。

2.1.1 供試品溶液制備 取供試品（未輻照及經(jīng)不同劑量輻照的黃精） 25 g, 加入無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液（pH=7.0） 225 mL, 40 ～45 ℃下恒溫振搖15 min, 取其清液,即得。

2.1.2 微生物計(jì)數(shù) 取供試品溶液及3 個(gè)連續(xù)10 倍稀釋級(jí)（10-2、 10-3、 10-4）, 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）澆碟法（1 mL/皿） 測(cè)定需氧菌總數(shù)； 取供試品溶液及2 個(gè)連續(xù)10 倍稀釋級(jí)（10-2、 10-3）, 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（含0.1 g/1 000 mL 慶大霉素） 澆碟法（1 mL/皿） 測(cè)定霉菌與酵母菌總數(shù)； 取供試品溶液, 沸水浴30 min 后按測(cè)定需氧菌總數(shù)的方法檢測(cè)耐熱菌數(shù)。

2.1.3 控制菌 （大腸埃希菌） 檢查 取供試品溶液10 mL, 接種至100 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中, 30 ～35 ℃下培養(yǎng)24 h, 取1 mL 上述培養(yǎng)物接種至100 mL 麥康凱液體培養(yǎng)基中, 42～44 ℃下培養(yǎng)48 h, 劃線接種于麥康凱瓊脂平板上, 30～35 ℃下培養(yǎng)72 h。 如有菌落生長(zhǎng), 則進(jìn)行分離純化及鑒定； 如無(wú)菌落生長(zhǎng), 則判斷為未檢出大腸埃希菌（實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照）。

2.1.4 微生物檢測(cè) 未經(jīng)輻照及經(jīng)不同劑量輻照的黃精在0、 1、 3、 6 個(gè)月測(cè)定需氧菌總數(shù)、 霉菌與酵母菌總數(shù)（控制菌在0 個(gè)月均未檢出, 以后未繼續(xù)檢測(cè)； 耐熱菌僅檢測(cè)了0 個(gè)月）, 結(jié)果見表1。

表1 微生物檢測(cè)結(jié)果

2.2 多糖含有量測(cè)定[11]

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取105 ℃下干燥至恒定質(zhì)量的葡萄糖對(duì)照品33.0 mg, 置于l00 mL 量瓶中, 加水溶解并稀釋至刻度, 搖勻, 即得 （每1 mL 含無(wú)水葡萄糖0.33 mg）。

2.2.2 供試品溶液制備 取不同劑量60Co-γ 輻照的黃精適量, 60 ℃下干燥至恒定質(zhì)量, 打成細(xì)粉, 精密稱取約0.25 g （每個(gè)樣品平行2 份）, 置于250 mL 圓底燒瓶中,加80%乙醇150 mL, 水浴中加熱回流1 h, 趁熱過濾, 殘?jiān)?0%熱乙醇洗滌3 次, 每次10 mL, 將殘?jiān)盀V紙置于燒瓶中, 加150 mL 水, 沸水浴中加熱回流1 h, 趁熱濾過, 殘?jiān)盁坑脽崴礈? 次, 每次10 mL, 合并濾液與洗液, 放冷, 轉(zhuǎn)移至250 mL 量瓶中, 加水至刻度, 搖勻, 即得。

2.2.3 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液0.1、 0.2、0.3、 0.4、 0.5、 0.6 mL, 置于10 mL 具塞刻度試管中, 各加水至2.0 mL, 搖勻, 冰水浴中緩慢滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度, 混勻, 放冷后置水浴中保溫10 min, 取出,立即置于冰水浴中冷卻10 min, 取出。 以相應(yīng)試劑為空白,紫外-可見分光光度法在582 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。 以吸光度為縱坐標(biāo)（A）, 質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X） 進(jìn)行回歸,得方程A = 0.033 7X-0.069 0 （r = 0.999 7）, 在3.3 ～19.8 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4 樣品含有量測(cè)定 取黃精適量, 按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 精密量取1 mL, 置于10 mL 具塞刻度試管中, 按“2.2.3” 項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度, 計(jì)算含有量, 結(jié)果見表2。

表2 多糖含有量測(cè)定結(jié)果（%， n=2）

3 討論

60Co-γ 射線輻照具有抑制作物發(fā)芽、 保鮮、 殺蟲滅菌等作用, 并且輻照滅菌法具有穿透力強(qiáng)、 滅菌效果好、 成本低廉、 適宜大規(guī)模生產(chǎn)等特點(diǎn), 已收載于《中國(guó)藥典》,但尚無(wú)黃精輻照的報(bào)道。 根據(jù)《60Co 輻照中藥滅菌劑量標(biāo)準(zhǔn)》 （衛(wèi)藥發(fā)[1997] 第38 號(hào)）, 中藥輻照滅菌時(shí)允許最大吸收劑量為散劑、 片劑3 kGy, 丸劑5 kGy, 中藥原料粉6 kGy, 結(jié) 合 相 關(guān) 文 獻(xiàn), 本 實(shí) 驗(yàn) 選 擇0.5、 1.0、 3.0、6.0 kGy。

黃精在貯藏過程中容易發(fā)生霉變, 不僅影響外觀, 還可能影響有效成分含有量, 導(dǎo)致療效降低, 甚至出現(xiàn)不良反應(yīng)。 本實(shí)驗(yàn)通過輻照技術(shù)防止黃精霉變, 延長(zhǎng)其貯藏期,故選擇需氧菌總數(shù), 霉菌、 酵母菌總數(shù)作為考察指標(biāo), 發(fā)現(xiàn)該藥材經(jīng)沸水浴30 min 后仍檢出耐熱菌, 而1.0 kGy60Co-γ 射線輻照則能有效殺滅。 此外, 還參考文獻(xiàn)[12]選擇大腸埃希菌作為控制菌, 結(jié)果未檢出, 表明未受其污染。

本實(shí)驗(yàn)測(cè)定黃精多糖含有量時(shí)采用2015 年版《中國(guó)藥典》 方法, 故未進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。 文獻(xiàn)[13] 報(bào)道, 輻照可引起多糖降解。 是否降解成分溶于80%熱乙醇而被過濾后含有量降低, 具體原因仍不清楚, 對(duì)其藥效有何影響也不明確； 唐梅、 曹夏等[14-15]研究表明, 黃精中多糖含有量隨著貯存時(shí)間延長(zhǎng)而呈下降趨勢(shì), 與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致, 并且經(jīng)60Co-γ 輻照后亦然。

4 結(jié)論

黃精經(jīng)0.5～6.0 kGy60Co-γ 射線輻照處理后, 在形態(tài)、色澤、 氣味上均無(wú)明顯改變； 微生物數(shù)量隨著輻照劑量增加顯著減少, 并且在貯藏過程中微生物增長(zhǎng)速度緩慢。 由此可知, 輻照在殺滅霉菌、 耐熱菌等方面效果明顯, 對(duì)黃精有明顯防霉作用, 但也可能導(dǎo)致多糖含有量降低, 值得關(guān)注。