藤茶總黃酮固體脂質納米粒處方的優化及其體外釋藥行為

楊毛毛， 羅花彩， 沙 玫， 徐 偉， 林珠燦*， 郭素華*

（1. 福建中醫藥大學藥學院， 福建 福州350122； 2. 福建中醫藥大學附屬人民醫院， 福建 福州350004）

藤茶為葡萄科蛇葡萄屬植物顯齒蛇葡萄Ampelopsis grossedentata （Hand-Mazz） W. T. Wang 的嫩莖葉[1], 具有清熱解毒、 利濕消腫之功效, 主治黃疸型肝炎、 感冒風熱、咽喉、 目赤腫痛等癥[2]。 近年來研究表明, 藤茶中總黃酮含有量高達40%以上, 其中二氫楊梅素（又稱福建茶素）為其特征性成分[3-4], 具有抗腫瘤、 抗炎抑菌、 抗氧化、 降糖降脂、 增強免疫功能、 保肝護肝、 抗動脈粥樣硬化等多種活性[4-9], 但其在體內消除快、 口服吸收差、 生物利用度低[10-11], 嚴重影響了臨床應用和體內藥效。

固體脂質納米粒是一種新型給藥體系, 以固態的天然或合成的類脂（如卵磷脂、 三酰甘油等） 為載體, 將藥物包裹或夾嵌于類脂核中, 制成粒徑約為10～1 000 nm 的固體膠粒而成[12], 它是以生理相容性好、 體內可降解、 無生物毒性的脂質為基質, 既能增加藥物穩定性, 又可延長半衰期, 進而提高藥效成分生物利用度, 同時又具有控釋作用和良好的靶向性, 以及納米粒藥物泄露少、 毒性低、 操作簡單等優點[12-13], 可廣泛應用于大規模生產, 但目前尚無藤茶總黃酮相關劑型處方與制備工藝的報道。 因此, 本實驗制備藤茶總黃酮固體脂質納米粒, 然后優化處方, 考察其體外釋藥行為, 為相關新劑型開發與臨床前研究提供實驗數據支撐。

1 材料

LC-20A 高效液相色譜儀、 SPD-M20A 紫外檢測器（日本島津公司）； JY92-II 型超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）； NICOMPTM380ZLS Zeta potential/particle sizer 納米粒度儀（美國Waters 公司）； DKZ 系列超級恒溫水浴振蕩器（上海一恒科技有限公司）； UFC501096超濾管（10 kD, 美國Millipore 公司）。

二氫楊梅素對照品（批號160422, 上海源葉生物科技有限公司, 含有量≥98%）； 楊梅苷（批號15081713, 含有量99.41%）、 楊梅素（批號15050810, 含有量98.31%）對照品（北京盈澤納新化工技術研究院）。 藤茶總黃酮原料藥由課題組自制（含有量≥80%）。 單硬脂酸油酯（批號20170213, 國藥集團化學試劑有限公司）； 泊洛沙姆188（批號WPAK527B, 德國BASF 公司）。 甲醇為色譜純（德國默克公司）； 其他試劑均為分析純； 水為超純水。

2 方法與結果

2.1 固體脂質納米粒制備[14]采用熔融-超聲法。 精密稱取泊洛沙姆188 適量, 超純水溶解, 加熱至75 ℃恒溫, 作為水相； 精密稱取適量藤茶總黃酮原料藥、 單硬脂酸甘油酯, 加少量乙醇與水相, 在同溫狀態下攪拌熔融, 作為油相, 待兩相完全溶解且溫度相同時, 將水相倒入油相中快速攪拌以充分混合, 混合液揮至無醇味時超聲波細胞粉碎機（變幅桿調至6, 功率200 W, 每超聲1 s 間隔2 s） 超聲5 min, 即得, 室溫冷卻后于4 ℃冰箱中保存。 同法制備空白固體脂質納米粒（不加藤茶總黃酮原料藥）。

2.2 包封率、 載藥量測定

2.2.1 色譜條件[15]TOP ODS-AQ 色譜柱 （4.6 mm×250 mm, 5 μm）； 流動相甲醇（A） -0.1% 磷酸（B）, 梯度洗脫（0 ～10 min, 35% A； 10 ～20 min, 35% ～80% A；20～30 min, 80% A）； 檢測波長252 nm （楊梅苷、 楊梅素）、 291 nm （二氫楊梅素）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫30 ℃； 進樣量10 μL。 色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.2.2 線性關系考察 精密稱取二氫楊梅素、 楊梅苷、 楊梅素對照品適量, 置于10 mL 量瓶中, 甲醇定容, 即得對照品溶液（質量濃度分別為505.68、 6.29、 13.42 μg/mL）,4 ℃下 保 存 備 用, 精 密 吸 取0.2、 0.5、 1.0、 2.0、 4.0、8.0、 10.0 mL 于10 mL 量瓶中, 甲醇稀釋成系列質量濃度,在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定。 以峰面積為縱坐標（Y）, 溶液質量濃度為橫坐標（X） 進行回歸, 結果見表1,可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系

2.2.3 精密度試驗 精密吸取對照品溶液適量, 在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定, 測得二氫楊梅素、 楊梅苷、 楊梅素日內精密度RSD 分別為0.62%、 0.82%、0.63%, 日間精密度RSD 分別為0.85%、 1.85%、 0.29%,表明該方法精密度良好。

2.2.4 穩定性試驗 于0、 2、 4、 6、 8、 12、 24、 48、 72 h吸取同一供試品溶液, 在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定, 測得二氫楊梅素、 楊梅苷、 楊梅素含有量RSD 分別為1.54%、 0.02%、 0.59%, 表明供試品溶液在72 h 內穩定性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗 取各成分含有量已知（二氫楊梅素512.96 μg/mL、 楊梅苷6.39 μg/mL、 楊梅素13.76 μg/mL）的供試品溶液, 在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定, 測得二氫楊梅素、 楊梅苷、 楊梅素平均加樣回收率分別為101.44%、 101.68%、 102.53%, RSD 分 別 為 1.30%、2.56%、 2.34%。

2.2.6 測定方法

2.2.6.1 游離總黃酮 精密吸取固體脂質納米粒混懸液500 μL 于超濾離心管中, 8 000 r/min 離心10 min, 取100 μL離心液, 甲醇定容至1 mL, 在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定。

2.2.6.2 總黃酮總量 精密吸取固體脂質納米粒混懸液500 μL 于10 mL 量瓶中, 甲醇加熱溶解, 定容, 搖勻,0.45 μm 微孔濾膜過濾, 在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定。

2.2.6.3 計算公式 包封率= [（W總-W游離） /W總] ×100%, 載藥量= （W總-W游離） / （W脂質+W總-W游離） （W總表示總黃酮總含有量, W游離表示游離總黃酮含有量, W脂質表示單硬脂酸甘油酯質量）。

2.2.7 超濾回收率試驗 精密吸取“2.1” 項下空白固體脂質納米粒混懸液0.1、 0.3、 0.4 mL 各3 份于超濾離心管中, 分別精密加入0.4、 0.2、 0.1 mL 對照品 溶液,8 000 r/min離心10 min, 取濾液, 在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定, 測得二氫楊梅素、 楊梅苷、 楊梅素超濾回收率分 別 為101.46%、 102.00%、 100.85%, RSD 分 別 為1.89%, 1.62%, 2.72%。

2.3 粒徑測定 精密吸取“2.1” 項下固體脂質納米粒混懸液100 μL, 超純水稀釋至10 mL 量瓶中, 搖勻, 納米粒度儀測定其粒徑和Zeta 電位。

2.4 處方優化 在前期預實驗基礎上, 以粒徑（Y1）、 包封率（Y2）、 載藥量（Y3） 為評價指標, 投藥量（A）、 藥脂比（B）、 乳化劑（泊洛沙姆188） 用量（C） 為影響因素,設計3 個水平進行處方優化。 因素水平見表2, 結果見表3。

表2 因素水平

表3 試驗設計與結果

通過Design-Expert 8.0 軟件對表3 數據進行二項擬合,得到方程分別為Y1= 137.52-3.37A-21.13B+23.06C+15.34AB-7.81AC-17.06BC+5.03A2+21.95B2+5.26C2（r=0.906 5, P＜0.05）、 Y2=87.38-0.61A+0.43B+1.38C （r=0.746 4, P ＞0.05）、 Y3= 7.95-0.11A-3.02B-0.18C-0.017AB-0.12AC+0.074BC-0.11A2+1.06B2-0.096C2（r=0.975 8, P＜0.05）, 可知各響應值與各因素水平的非線性擬合效果較好, 其中Y1、 Y3相關系數較大, 對粒徑、 載藥量的影響較顯著（P＜0.05）。

響應面分析見圖2。 綜合考慮后期大規模生產的可行性及經濟成本, 確定最優處方工藝為投藥量0.48%, 藥脂比1 ∶5, 乳化劑用量6.6%, 粒徑158.4 nm, 包封率86.13%,載藥量12.15%。然后, 平行制備6 份固體脂質納米粒混懸液, 測定粒徑、包封率、 載藥量, 結果見表4, 可知優化工藝重復性良好,具有可行性。 粒徑分布、 Zeta 電位分別見圖3～4。

圖2 各因素響應面圖

表4 驗證試驗結果（n=6）

圖3 納米粒粒徑分布

圖4 納米粒Zeta 電位

2.5 體外釋藥行為評價 采用平衡透析法[11], 釋放介質為pH 5.8 磷酸鹽緩沖液（含2%吐溫80）, 介質體積100 mL,介質溫度（37±0.5）℃, 轉速100 r/min。 精密移取適量固體脂質納米粒混懸液（藤茶總黃酮含有量4.8 mg/mL） 于預先處理的透析袋（截留分子量8 000～14 000 Da） 中, 透析袋夾夾緊兩端袋口后置于釋放介質中, 于0.5、 1、 2、 4、8、 12、 24、 48 h 用100 mL 等溫新鮮釋放介質置換, 吸取1 mL釋放介質, 0.45 μm 微孔濾膜過濾后棄去初濾液,HPLC 法測定二氫楊梅素、 楊梅苷、 楊梅素含有量； 精密稱取原料藥適量, 磷酸鹽緩沖液（pH=5.8） 加熱溶解, 制成質量濃度與固體脂質納米粒相同的溶液, 同法進行釋放試驗, 計算累積釋放率（Qi）, 公式為Qi= （C1+C2+……+Ci） V/C0V0（V0、 C0分別為透析袋中加入樣品的體積、 質量濃度, V 為透析介質體積, Ci為每個時間點測得的總黃酮質量濃度）, 結果見圖5。 由圖可知, 原料藥4 h 內累積釋放率為97.59%, 基本釋放完全； 納米粒在4 h 前釋放較快, 累積釋放率為79.64%, 后期呈現緩釋, 24 h 基本釋放完全, 累積釋放率為98.81%。

圖5 樣品體外釋藥曲線

在此基礎上, 對固體脂質納米粒、 原料藥的體外釋藥數據進行零級、 一級、 Higuchi、 Weibull、 Korsmeyer-Peppas 模型的擬合, 結果見表5。 由表可知, 兩者的釋放動力學相同,Weibull 模型擬合效果最好（R2分別為0.999 5、 0.999 6）。

表5 體外釋放曲線擬合方程

3 討論

固體脂質納米粒的制備方法主要包括高壓均質法、 微乳法、 溶劑蒸發法、 乳化蒸發-低溫固化法、 薄膜接觸器法、 相轉換法、 熔融超聲法、 高剪切乳化超聲法、 溶劑注射法等[13,16]。 根據藤茶總黃酮理化性質及實驗室條件, 本實驗選擇簡便易行、 操作可控的熔融超聲法, 所得固體脂質納米粒粒徑較小, 均勻穩定, 混懸液具有明顯的乳光。

前期對藤茶總黃酮固體脂質納米粒處方進行考察時,曾選用山崳酸甘油酯作脂質材料, 其粒徑偏大, 均為220 nm左右, 包封率最高達83%； 選用單硬脂酸甘油酯時,粒徑變小, 包封率、 載藥量均有所提高, 另外以泊洛沙姆188 為乳化劑時藥物溶解性好, 安全性高, 故選擇單硬脂酸甘油酯和泊洛沙姆作為處方。 與文獻報道的藤茶總黃酮主成分二氫楊梅素脂質體[11]、 長循環納米脂質體[17]相比,本實驗所得固體脂質納米粒包封率（87.27%） 和載藥量（12.43%） 均明顯提升。

相較于常用的正交設計和均勻設計, 星點設計、 Box-Beheken 響應面法設計精度更高, 可靈敏地考察各因素間的交互作用, 精確找出最佳點, 并且預測性良好。 本實驗采用星點設計-響應面法, 通過Design Expert 軟件對實驗數據進行二項式擬合, 發現模型擬合度較好, 同時驗證試驗顯示該方法預測性良好, 制備工藝簡便易行。

體外釋放度是評價載藥體系的重要指標, 本實驗采用經典動態透析法進行考察, 選擇零級、 一級、 Higuchi、Weibull、 Korsmeyer-Peppas 等模型進行體外釋放數據擬合,發現其釋放曲線最符合Weibull 方程。 實驗中發現固體脂質納米粒在初期釋放較快, 推測可能是游離藥物及固體脂質納米粒表面吸附的藥物共同釋放； 后期釋放趨于平緩, 可能與藥物從載體骨架中擴散, 或隨載體材料降解而釋放相關。 而且與原料藥相比, 固體脂質納米粒具有一定的緩釋特性。

藤茶總黃酮開發前景良好, 為了改善其生物利用度,制備相關制劑是亟待解決的問題之一。 本實驗采用熔融超聲法制備藤茶總黃酮固體脂質納米粒, 后續將對其質量進行全面評價, 并進行體內、 體外抗癌藥效學、 藥代動力學等研究, 以期進一步提高其口服生物利用度及抗癌靶向性。