麩煨訶子不同部位抗?jié)冃越Y腸炎的譜效關系

溫聰聰， 鞠成國， 張 強， 賈 茹， 王 巍

（遼寧中醫(yī)藥大學藥學院， 遼寧 大連116600）

訶子收載于2015 年版《中國藥典》 一部, 為使君子科植物訶子Terminalia chebula Retz. 或絨毛訶子Terminalia chebula Retz. var. tomentella Kurt.的干燥成熟果實, 具有澀腸止瀉、 斂肺止咳之功效[1]。 在藏蒙醫(yī)學中訶子應用非常廣泛[2], 其地位相當于中藥方劑中的甘草[3]。 傳統(tǒng)醫(yī)學中, 訶子存在生熟異用, 《本經逢原》 中有“生用清金止嗽, 煨熟固腸止瀉” 的記載。 訶子煨后主治久瀉、痢疾、 腸風、 瀉血, 即中醫(yī)的“腸澼”, 在現代臨床上與潰瘍性結腸炎相對應[4]。 本實驗以潰瘍性結腸炎動物模型為對象, 對訶子煨后固腸止瀉藥效物質進行研究, 比較灌胃給予水提部位、 正丁醇部位、 乙酸乙酯部位后藥效學指標的差別, 確定有效部位。 并采用HPLC 分別建立麩煨訶子水提部位、正丁醇部位、 乙酸乙酯部位的指紋圖譜, 利用灰色關聯(lián)分析法建立共有指紋峰與藥效指標之間的關系, 篩選對藥效貢獻較大的特征峰, 為明確訶子煨后固腸止瀉的炮制原理提供理論基礎。

1 材料

安捷倫1100 高效液相色譜系統(tǒng)（美國Agilent公司）； FA1004B 電子天平（上海精密科學儀器有限公司）； 臺式高速微量離心機（湖南可成儀器設備有限公司）； FSH-2A 可調高速勻漿機（常州市國旺儀器制造有限公司）； Multiskan Mk 3 型酶標儀（賽默飛世爾上海儀器有限公司）。

10 批訶子藥材經遼寧中醫(yī)藥大學翟延君教授鑒定為正品, 信息見表1。 柳氮磺胺吡啶腸溶片（批號H31020840, 上海福利達制藥有限公司）；沒 食 子 酸 （批 號17010103）、 鞣 花 酸 （批 號17031010） 均購于成都曼斯特生物科技有限公司。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

小鼠丙二醛 （MDA）、 超氧化物歧化酶（SOD）、 白細胞介素1β （IL-1β）、 白細胞介素10（IL-10）、 腫瘤壞死因子α （TNF-α） 試劑盒（上海朗頓生物科技有限公司, 批號分別為20171014TT、 20171014HF、 20171014HS、20171014GP、 20171014JA）； 甲醇為色譜純； 水為純凈水； 乙酸乙酯、 正丁醇、 冰乙酸、 磷酸均為分析純（天津科密歐化學試劑有限公司）。

SPF 級小鼠, 體質量18 ～22 g, 購于遼寧長生生 物 技 術 有 限 公 司, 批 號 為 SCXK （ 遼）2015-0001。

2 方法與結果

2.1 HPLC 指紋圖譜建立

2.1.1 麩煨訶子制備 取訶子生品適量, 以藥材∶麥麩（100 ∶40）投入鍋中, 溫度控制在130 ～150 ℃, 麩煨20 min, 即得。

2.1.2 供試品溶液制備 取各批次麩煨訶子（去核） 適量, 粉碎, 過60 目篩。 稱取藥材粉末20 g,加10 倍量乙酸乙酯浸泡0.5 h, 加熱回流提取3次, 1 h/次, 過濾, 合并濾液； 藥渣晾干, 以正丁醇同法處理； 另取藥材粉末20 g, 以純凈水同法處理, 即得3 個部位提取液。 精密量取各提取液30 mL, 減壓回收溶劑, 以70%甲醇復溶, 定容于25 mL 量瓶, 搖勻, 精密量取溶液1 mL 置于10 mL量瓶中, 加甲醇至刻度, 搖勻, 用0.45 μm 微孔濾膜過濾, 濾液為供試品溶液。 剩余各部分減壓回收溶劑, 冷凍干燥得各部位提取物, 以備藥效實驗用。

2.1.3 對照品溶液制備 精密稱取對照品沒食子酸、 鞣花酸適量, 加甲醇配制成0.022 4 mg/mL 沒食子酸、 0.035 1 mg/mL 鞣花酸的混合對照品溶液。

2.1.4 色譜條件 安捷倫C18柱 （250 nm ×4.6 mm, 5 μm）； 流 動 相 甲 醇 （A） -磷 酸 水（B）, 梯度洗脫（0～8 min, 95.0% ～90.0%B； 8 ～15 min, 90.0% ～75.0%B； 15 ～25 min, 75.0% B；25 ～30 min, 75.0% ～70.0% B； 30 ～50 min,70.0% ～55.0%B； 50 ～55 min, 55.0%B）； 體積流量1.0 mL/min； 檢測波長270 nm； 柱溫30 ℃； 進樣量10 μL[5]。

2.1.5 指紋圖譜 按“2.1.2” 項下方法制備供試品溶液, 在“2.1.4” 項色譜條件下進樣, 利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件（2004A 版）進行共有峰的匹配。 3 個部位的指紋圖譜來源于10批麩煨訶子樣品, 分別與其生成的對照圖譜比較,水提部位、 正丁醇部位、 乙酸乙酯部位相似度分別在0.924 ～0.992、 0.925 ～0.990、 0.912 ～0.984 之間, 分別有32、 22、 18 個共有峰, 見圖1。

2.2 藥效實驗

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2.1 供試藥液制備 將“2.1.2” 項下各部位提取物, 用0.5% 羧甲基纖維素鈉（CMC-Na） 溶液配成質量濃度為0.14 g/mL 的藥液（以生藥量計算）, 再將各批次的藥液合并混勻, 即得3 個部位供試藥液（混合藥液分別對應3 個部位指紋圖譜）； 稱取陽性藥柳氮磺胺吡啶片劑適量, 研細,加0.5%CMC-Na 溶液配成0.05 g/mL 藥液, 4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 動物造模和給藥 小鼠于實驗室適應性喂養(yǎng)7 d 后, 隨機分為空白組、 模型組、 陽性藥組、水提部位組、 正丁醇部位組、 乙酸乙酯部位組, 每組8 只。 參考文獻[6-7], 采用乙酸灌腸法建立小鼠潰瘍性結腸炎模型, 空白組小鼠以生理鹽水代替乙酸同法制備。 造模24 h 后, 按體質量0.1 mL/10 g灌胃給藥, 各給藥組給予對應提取部位的藥液, 陽性藥組以柳氮磺胺吡啶藥液灌胃, 空白組和模型組以0.5% CMC-Na 溶液灌胃, 1 次/d, 連續(xù)7 d, 于第8 d 眼球取血后處死, 解剖取結腸, 測量長度并稱定質量。 取2 cm 結腸組織, 剪碎, 加磷酸鹽緩沖溶液（PBS） 制成10% 的組織勻漿[8]。 將眼球血和組織勻漿液置于離心管中, 3 000 r/min離心20 min, 吸取上清保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 指標測定與數據處理 采用ELISA 法對樣本進行指標測定。 取血清樣本, 按MDA、 SOD 試劑盒說明書操作； 取結腸組織樣本, 按IL-1β、TNF-α、 IL-10 試劑盒說明書操作。 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數據處理。

2.2.4 對藥效指標的影響 表2 ～3 顯示, 與空白組相比, 模型組小鼠血清MDA 顯著升高, SOD 活性顯著降低, 結腸組織IL-1β、 TNF-α 含有量顯著升高, 而IL-10 含有量顯著降低（P＜0.01）。 與模型組相比, 各給藥組的血清和結腸組織MDA、 IL-1β、 TNF-α 含有量均顯著降低, SOD 活性、 IL-10含有量均顯著升高（P＜0.01）。 不同部位組間比較, 僅與水提部位組比較, 正丁醇部位組SOD 活性增強存在顯著性差異（P＜0.05）。

表2 麩煨訶子不同部位對血清中MDA、 SOD 的影響 ±s， n=8）Tab.2 Effects of different parts of T. chebula roasted with wheat bran on content of serumal MDA， SOD ±s， n=8）

表2 麩煨訶子不同部位對血清中MDA、 SOD 的影響 ±s， n=8）Tab.2 Effects of different parts of T. chebula roasted with wheat bran on content of serumal MDA， SOD ±s， n=8）

注：與空白組比較,＃＃P＜0.01；與模型組比較,**P＜0.01；與水提組比較,ΔP＜0.05

images/BZ_162_236_1153_1194_1203.png空白組 4.83±0.51 86.68±1.50模型組 33.79±1.28＃＃ 24.77±1.98＃＃陽性藥組 7.41±0.50** 59.62±4.68**水提部位組 10.07±1.23** 60.87±3.47**正丁醇部位組 9.64±1.22** 69.77±4.37**Δ乙酸乙酯部位組 10.45±1.61** 66.78±4.46**

表3 麩煨訶子不同部位對腸組織中IL-1β、 TNF-α、 IL-10的影響s， n=8）Tab.3 Effects of different parts of T. chebula roasted with wheat bran on content of intestinal tissues of IL-1β， TNF-α， IL-10 ， n=8）

表3 麩煨訶子不同部位對腸組織中IL-1β、 TNF-α、 IL-10的影響s， n=8）Tab.3 Effects of different parts of T. chebula roasted with wheat bran on content of intestinal tissues of IL-1β， TNF-α， IL-10 ， n=8）

注：與空白組比較,＃＃P＜0.01；與模型組比較,**P＜0.01

?

2.3 不同部位指紋圖譜與藥效關系 參照灰色關聯(lián)分析法, 本實驗中以藥效指標數值為參考序列,以指紋圖譜共有峰面積數據為比較序列[9], 首先對共有峰峰面積進行無量綱化處理[10], 再通過灰色關聯(lián)軟件（V 3.0） 將指紋圖譜共有峰數據分別與5 組藥效數值進行關聯(lián)分析, 最終以5 組關聯(lián)度的均值表示二者關聯(lián)結果。

結果見表4, 灰色關聯(lián)分析得出, 麩煨訶子抗小鼠潰瘍性結腸炎作用貢獻度較大的峰（編號）順序為21＞9＞25＞30＞14＞31＞28＞3＞32＞13＞26＞15＞8 號, 關聯(lián)度均在0.70 以上, 表明其所代表的化學成分抗小鼠潰瘍性結腸炎作用的關聯(lián)度較大, 其中32 號峰為鞣花酸, 3 號峰為沒食子酸。

表4 麩煨訶子不同部位共有峰數據與其藥效相關性Tab.4 Correlation between the common peak data of different parts of T. chebula roasted with wheat bran and efficacy

3 討論

潰瘍性結腸炎的臨床癥狀主要表現為泄瀉、 腹痛、 便中帶血[11], 本實驗采用乙酸灌腸法復制小鼠潰瘍性結腸炎模型, 造成小鼠稀血樣便、 肛門污穢、 體質量下降、 皮毛無光澤等狀況, 與潰瘍性結腸炎的臨床癥狀相符； 與空白組相比, 模型小鼠血清MDA 含有量升高, SOD 活性降低, 結腸組織中促炎因子IL-1β、 TNF-α 水平升高, 抑炎因子IL-10水平下降。 MDA 是機體自由基參與過氧脂化反應的產物, 具有細胞毒性, 損害機體[12]； SOD 是1種活性酶, 可以清除自由基, 活性降低, 清除作用減小, 導致自由基反應增加[13-14]； 同時, 結腸中促炎因子和抑炎因子的失衡導致腸道內環(huán)境紊亂,從而加重炎癥[15]。 經過給藥治療后, 各給藥組小鼠狀態(tài)與模型組相比得到明顯改善, 各項指標與模型組具有顯著性差異, 表明麩煨訶子3 個部位提取物通過減少模型小鼠體內自由基的表達, 下調IL-1β、 TNF-α, 促進IL-10 產生, 達到改善小鼠潰瘍性結腸炎的作用； 比較組間不同部位的各項指標,除正丁醇組SOD 活性較水提部位組增強具有顯著性差異外, 其余指標無顯著性差異, 無法比較出藥效最好的部位, 但是正丁醇部位治療小鼠潰瘍性結腸炎作用的趨勢較明顯。

本研究藥效實驗存在5 組指標數值, 每組藥效數值與共有峰數據計算關聯(lián)度, 得到5 組關聯(lián)度結果。 比較發(fā)現不同指標對同一個特征峰會表現出不同的關聯(lián)度, 這表明不同指標受到某一成分的調控作用是不同的, 無從判斷哪一組藥效數值對應的關聯(lián)度結果更接近正確值[16]。 因此, 本實驗以5 組關聯(lián)度的均值[17]作為綜合關聯(lián)度, 來判斷共有峰對藥效的貢獻度。 可以更好地反映特征峰與抗小鼠潰瘍性結腸炎作用的關系, 提高可信度, 故認為綜合關聯(lián)度較大的21、 9、 25、 30、 14、 31、 28、 3、32、 13、 26、 15、 8 號峰代表的化學成分是麩煨訶子抗小鼠潰瘍性結腸炎作用的基本藥效成分, 將3個部位中的上述峰的峰面積加和, 正丁醇部位的峰面積總和最大, 表明這些峰所代表的化學成分在正丁醇部位中含有量最多, 符合藥效實驗得到的結果, 即正丁醇部分表現出更好的治療趨勢。 但對于上述共有峰, 目前只確定了32 號鞣花酸和3 號沒食子酸, 其他化學成分的確定有待后期研究。

本課題前期實驗[18]發(fā)現31 號峰在麩煨后峰面積減小, 而與其相連的32 號峰峰面積增加, 二者對抗小鼠潰瘍性結腸炎作用的貢獻度都較大, 推測二者在訶子麩煨過程中發(fā)生轉化, 對此驗證仍需進一步研究。

本實驗通過麩煨訶子不同部位譜效關系研究,初步明確了麩煨訶子固腸止瀉作用的藥效物質, 以期為進一步探討訶子煨后固腸止瀉的炮制原理提供參考。