不同干燥方式澤瀉湯指紋圖譜的建立及2 種成分測定

伍蕊嗣， 姚運秀， 劉 錢， 楊 慧， 曾琦璐， 劉 濤*

（1. 成都大學藥學與生物工程學院， 四川 成都610106； 2. 四川省中醫藥科學院， 四川 成都610041； 3.廣西中醫藥大學藥學院， 廣西 南寧530001）

中藥經典名方澤瀉湯出自東漢張仲景《金匱要略·痰飲咳嗽病》篇, 原文記載為“心下有支飲, 其人苦冒眩, 澤瀉湯主之” “澤瀉五兩, 白術二兩, 右二味, 以水二升, 煮取一升, 分溫再服”。 澤瀉湯由澤瀉和白術2 味藥組成, 具有消飲利水、 調補脾腎之功效, 系歷代醫家治療痰飲所致眩暈之效方。 目前廣泛應用于臨床, 療效顯著, 現代多用于治療梅尼埃病、 良性陣發性位置性眩暈、椎基底動脈供血不足等眩暈病[1]。

古代經典名方制劑的研制分標準煎液與制劑研制2 個階段, 標準煎液應作為經典名方制劑藥用物質確定的基準[2]。 干燥是其制備工藝中必不可少的步驟, 減壓、 常壓、 噴霧、 冷凍干燥是中藥提取物常見的干燥方式, 由于原理及加熱方式不同, 不同的干燥方式可能會對產物的成分含有量及物理性質產生影響[3-4]。

目前干燥方式對藥物的影響多以指標成分含有量作為評價依據, 不能全面地反應對物料的影響,不同干燥方式會對產物的粉體學性質產生影響, 進而關系到制劑工藝過程及質量, 最終影響制劑安全性、 穩定性及有效性。 然而這方面的研究卻不多[5], 未查見關于經典名方標準煎液干燥方式的研究報告, HPLC 指紋圖譜是中藥整體質量評價思路的重要體現, 這一技術已廣泛應用于中藥質量評價[6]。 HPLC 波長切換指紋圖譜能反映樣品更多的化學信息, 色譜峰分離效果更好, 數量更多, 峰型更美觀, 以達到更好的整體質量控制目的[7-8]。

為了更全面地研究不同干燥方式對澤湯標準煎液的物理及化學性質的影響[9], 本研究通過建立HPLC 指紋圖譜、 物理指紋譜及成分含有量測定,考察4 種干燥方式對經典名方澤瀉湯標準煎液的影響, 以期為澤瀉湯制劑的研發提供參考。

1 儀器與材料

SQP Satorious 型電子天平[賽多利斯科學儀器（北京） 公司]； BS-6KH 型電子天平（上海友聲衡器公司）； FA2004 型電子分析天平（上海良平儀器儀表公司）； 3～9 號藥典篩（道墟化驗儀器廠）；DSH-10 A 型電子水分測定儀（邦西儀器科技公司）； HS-3120 型超聲波清洗器（天津市恒奧科技公司）； TD5 型臺式多管架離心機（長沙英泰儀器公司）； TU-1810 型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器公司）； P230Ⅱ型高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器公司）； Waters 2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）。

澤瀉飲片（批號20180301）、 白術飲片（批號20180301） 均購自四川省成都市金牛區荷花池中藥材市場, 經成都大學劉濤高級工程師鑒定分別為正品。 23-乙酰澤瀉醇B 對照品（wkq16040904）、白術內酯Ⅲ對照品 （wkq16092604）, 含有量≥98%, 均購于四川省維克奇生物科技公司； 氯化鈉（2017081101, 成都市科龍化工試劑廠）。

2 方法與結果

2.1 澤瀉湯標準煎液制備 在單因素試驗的基礎上, 利用星點設計-效應面法確定了澤瀉湯標準煎液的提取工藝, 以白術內酯Ⅲ轉移率為指標確定了其濃縮工藝, 即取澤瀉和白術飲片（5 ∶2） 適量,加13.41 倍水回流提取, 提取3 次, 2.21 h/次,趁熱過濾, 取濾液進行減壓濃縮（80 ℃, -0.08 ～-0.09 MPa） 至密度為1.05～1.10 （80 ℃）。

經前期4 種干燥方式工藝參數優選后, 將同一批浸膏等分為4 份, 分別進行常壓干燥（80 ℃）、減 壓 干 燥 （80 ℃, - 0.08 MPa）、 冷 凍 干 燥（t預凍= 2 h, - 55 ℃, P ＜10 Pa）、 噴 霧 干 燥（T進風=150 ℃, T出風=60 ℃）, 所得干膏含水量分別為4.48%、 4.19%、 4.04%、 4.54%, 將所得干膏經相同粉碎時間后過2 號篩, 即得。

2.2 物理指紋圖譜[10-14]

2.2.1 物理屬性確定 共篩選出9 個物理參數,分別為相對均齊指數（Iθ） 是指粉末粒徑的分布均勻程度； 松密度（Da） 表示粉末的工藝性能, 是指粉末在規定條件下自由充滿標準容器后所測得的堆積密度； 振實密度（Dc） 是指粉末在規定條件下經振實所測得的單位容積的質量； 豪斯納比（IH） 表示粉末的流動性, 數值越接近于1, 則流動性越好； 休止角（α） 是衡量粉末流動性的重要參數, α＜30°時流動性好, α＞45°時流動性差； 卡爾指數（IC） 表示粉末能夠被震實的能力； 顆粒間孔隙率（Ie） 表示粉末的可壓性； 吸濕性（H）表征粉末的穩定性, 是指物質在一定環境條件下吸附水分的能力； 干燥失重（HR） 是指物料中水分及揮發性成分含有量, 其高低不僅對物料成分含有量有影響, 還可能導致物料變質, 是1 個重要的物理參數。

以上9 個參數, 為物理指紋譜的二級指標。 根據澤瀉湯標準煎液物理性質, 將其粉體學質量屬性分為5 個物理指紋譜一級指標, 即穩定性、 均一性、 流動性、 堆積性和可壓性。 以吸濕性和干燥失重表征穩定性； 以相對均齊指數表征均一性； 以豪斯納比及休止角表征流動性, 良好的流動性可保證固體制劑的成型工藝和產品質量； 以振實密度和松密度表征堆積性； 以卡爾指數和顆粒間孔隙率表征可壓性。

2.2.2 測定方法 物理指紋譜二級指標的測定首選法定標準收載方法。 松密度, 取潔凈、 干燥的50 mL 量筒, 將20 g 左右待測粉末緩慢地加入到量筒中, 輕輕抹平粉末表面, 讀取待測粉末的體積；振實密度, 將上述盛有待測粉末的量筒, 同一高度上下振動200 次, 讀取待測粉末的體積； 相對均齊度指數, 將待測粉末依次過藥典篩3 ～9 號篩, 振蕩5 min, 分別記錄每個篩網上截留的粉末質量。取平均孔徑分別為0.302 5、 0.215 0、 0.165 0、0.137 5、 0.107 5、 0.082 5 mm 的篩網截留的粉末, 計算相對均齊度指數, 公式為Iθ=Fm/100+（dm-dm-1） Fm-1+ （dm+1-dm） Fm+1+ （dm-dm-2）Fm-2+ （dm+2-dm） Fm+2…（dm+n-dm） Fm+n, 其中, Fm為中間粒徑范圍粉末的質量百分比, Fm-1為中間粒徑范圍下一層粉末的質量百分比, Fm+1為中間粒徑范圍上一層粉末的質量百分比, n 為所確定的粒徑范圍個數, dm為中間粒徑范圍的粉末平均粒徑,dm-1為中間粒徑范圍下一層的粉末平均粒徑, dm+1為中間粒徑范圍上一層的粉末平均粒徑； 豪斯納比, 由松密度和振實密度計算而得, 公式為IH=Dc/Da； 休止角, 采用固定漏斗法測定, 將2 個漏斗串聯放置漏斗下端頂尖位置距離坐標紙的高度為H, 緩慢勻速地將粉末倒入漏斗中, 直至粉末所形成圓錐體的頂尖接觸到漏斗的頂尖位置時, 計算圓錐體底面半徑R, 公式為α=tan-1（H/R）； 顆粒間空隙率, 由松密度和振實密度計算而得, 公式為Ie= （Dc-Da） / （Da×Dc）； 卡爾指數, 由松密度和振實密度計算而得, 公式為IC= （Dc-Da） ×100/Dc； 干燥失重, 使用快速水分測定儀, 取約3 g待測粉末平鋪于樣品盤中, 于105 ℃下加熱10 min, 根據儀器顯示的最終讀數記錄即可； 吸濕性為取干燥的蒸發皿置于下部盛有飽和氯化鈉水溶液的恒溫干燥器中, 12 h 后精密稱定質量（m1）。取約3 g 待測粉末平鋪于上述蒸發皿中, 精密稱定質量（m2）。 將蒸發皿置于上述恒溫干燥器中,24 h后精密稱定質量（m3）。 計算其吸濕性, 公式為H= （m3-m2） / （m2-m1）。

2.2.3 物理參數標準化轉換 由于二級物理質量指標的數值和量綱不同, 為了方便在同一雷達圖更加直觀的表現出來, 參照藥典標準和相關文獻資料, 確定每個指標的可能數據范圍, 然后將其所測的物理參數數值標準化至0～10, 見表1。

表1 物理質量指標的可接受范圍及標準化轉換公式Tab.1 Limit values accepted for the physical quality indexes and standardized conversion formula

2.2.4 物理指紋譜建立 取經4 種干燥方式所得的3 批澤瀉湯標準煎液, 按“2.2.2” 項下方法測定并按表1 標準化轉換物理參數, 構成不規則的九邊形疊加物理指紋譜, 結果見圖1。

2.2.5 相似度分析 以減壓干燥為基準, 采用SPSS 數據處理軟件中Pearson 法對4 種干燥方式所得3 批澤瀉湯標準煎液物理指紋譜進行相似度分析, 比較不同干燥方式所得澤瀉湯標準煎液的物理性質差異, 結果見表2。

表2 物理指紋譜相似度Tab.2 Similarities of physical fingerprints

圖1 各樣品物理指紋譜Fig.1 Physical fingerprints of various samples

其余3 種干燥方式與減壓干燥方式所得物理指紋譜相似度均值的RSD 54.99%, 結果表明, 不同干燥方式對澤瀉湯標準煎液物理指紋譜有較大影響。

2.3 HPLC 指紋圖譜

2.3.1 供試品溶液制備 精密稱定干膏粉末1 g于100 mL 錐形瓶中, 精密移取10 mL 甲醇作為溶劑, 稱定質量, 超聲40 min, 冷卻至室溫后, 稱定質量, 補足溶劑, 混勻后過0.45 μm 有機濾膜即得。

2.3.2 色譜條件[15]依利特Supersil C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm, 5 μm）； 柱溫35 ℃； 流動相乙腈 （A） -水 （B）, 梯度洗脫 （0 ～30 min,10% ～45% A； 30 ～85 min, 45% ～90% A； 85 ～90 min, 90% ～10% A； 90 ～100 min, 10% A）； 體積流量1 mL/min； 檢測波長（0 ～50 min, 240 nm；30～85 min, 240 ～210 nm； 85 ～90 min, 210 nm）；進樣量10 μL。

2.3.3 方法學考察（減壓干燥樣品）

2.3.3.1 精密度試驗 按“2.3.1” 項下方法制備供試品溶液, 在“2.3.2” 項色譜條件下, 連續進樣6 次, 測得各共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD 分別在2.54%和0.63% 內, 表明儀器精密度良好。

2.3.3.2 穩定性試驗 按“2.3.1” 項下方法制備供試品溶液, 在“2.3.2” 項色譜條件下, 于配制后0、 2、 4、 6、 8、 10 h 連續進樣6 次, 測得各共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD 分別在1.71%和0.46%內, 表明供試品溶液在10 h 內穩定性良好。

2.3.3.3 重復性試驗 按“2.3.1” 項下方法制備供試品溶液6 份, 在“2.3.2” 項色譜條件下進樣, 測得各共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD 分別在1.74% 和0.43% 內, 表明該方法重復性良好。

2.3.3.4 HPLC 指紋圖譜建立 取3 批經4 種干燥方式所得澤瀉湯標準煎液, 按“2.3.1” 項下方法制備供試品溶液, 在“2.3.2” 項色譜條件下進樣, 得不同干燥方式澤瀉湯標準煎液的HPLC 疊加指紋圖譜, 結果見圖2。

圖2 12 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of twelve batches of samples

2.3.3.5 相似度分析 以減壓干燥為基準, 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A 版軟件對4 種干燥方式所得3 批澤瀉湯標準煎液HPLC 指紋圖譜進行相似度分析, 結果見表3。

表3 12 批樣品相似度Tab.3 Similarities of twelve batches of samples

其余3 種干燥方式與減壓干燥方式所得HPLC指紋圖譜相似度均值RSD 6.54%, 表明, 不同干燥方式對澤瀉湯標準煎液HPLC 指紋圖譜有一定影響。

2.4 樣品含有量測定

2.4.1 色譜條件[16-17]依利特Supersil C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm, 5 μm）； 柱溫35 ℃； 流動相乙腈（A） -水（B）； 體積流量1 mL/min； 檢測波長白術內酯Ⅲ220 nm, 23-乙酰澤瀉醇B 208 nm；進樣量10 μL。

2.4.2 樣品含有量 按“2.3.1” 項下方法制備供試品溶液, 在“2.4.1” 項色譜條件下進樣, 以干燥品計算23-乙酰澤瀉醇B 和白術內酯Ⅲ的含有量, 結果見表4。

表4 不同干燥方式各成分含有量測定結果（μg/g）Tab.4 Results of content determination of various constituents in different drying methods （μg/g）

4 種干燥方式23-乙酰澤瀉醇B 含有量均值的RSD 25.48%, 含有量排序為冷凍干燥＞減壓干燥＞常壓干燥＞噴霧干燥； 白術內酯Ⅲ含有量均值的RSD 25.89%, 含有量排序為冷凍干燥＞減壓干燥＞常壓干燥＞噴霧干燥, 表明不同干燥方式所得澤瀉湯標準煎液成分含有量有一定差別, 且減壓干燥與常壓干燥對以上2 種成分含有量的影響差距不大,最終優選冷凍干燥。

3 討論

標準煎液作為經典名方制劑藥用物質確定的基準, 在古代經典名方制劑的研制中占有極其重要的地位, 經典名方制劑的質量標準必須依據標準煎液進行制定。 而如何建立能反應理化屬性的指標成為其質量標準研究的關鍵[18]。

對中藥整體質量進行控制是對中藥質量評價的重要途徑, 采用指紋圖譜對其進行宏觀綜合分析是1 種有效的手段, 主要有液相、 氣相、 質譜、 紫外、 紅外光譜法等[5]。 目前, HPLC 一般是在單一波長下對出峰物質進行控制, 澤瀉湯標準煎液在單一波長下出峰不多, 無法反映其更多的化學信息,本研究采用了波長切換的方法, 采集不同保留時間及不同吸收波長下更多的物質信息, 達到了更好的整體質量控制目的。 不同的物料有不同的物理性質, 本研究建立的物理指紋圖譜包含9 個二級指標去反應物料的吸濕性、 流動性及均一性等, 亦可為整體質量控制方式。

本研究以減壓干燥方式所得到的物料為基準,與其余3 種干燥方式所得物料的HPLC 和物理指紋譜的相似度、 白術內酯Ⅲ及23-乙酰澤瀉醇B 含有量測定結果的RSD 值指為指標, 通過其大小來判斷不同干燥方式對澤湯湯標準煎液理化性質的影響, 方法簡單可行。 結果表明不同干燥方式對澤瀉湯標準煎液粉末可壓性影響較大； 對HPLC 指紋圖譜中色譜峰3 （未知共有峰） 和色譜峰11 （未知共有峰） 及23-乙酰澤瀉醇B 和白術內酯Ⅲ的含有量有一定的影響。 綜合考慮, 4 種干燥方式中, 冷凍干燥為澤瀉湯標準煎液的最佳干燥方式。