異甘草素對結直腸癌細胞增殖、 侵襲和遷移的影響

王志國， 黃賢明*， 趙 雁， 王其亮， 竇曉靜， 王 俊， 盧 娜

[1. 青島市中醫醫院（海慈醫療集團） 急診科， 山東 青島266003； 2. 青島市中醫醫院（海慈醫療集團）血液透析室， 山東 青島266003； 3. 青島市中醫醫院（海慈醫療集團） 藥劑科， 山東 青島266003]

結直腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤, 其發病率在全球范圍內位于前三位, 其發生的主要因素有遺傳、 環境、 生活方式等, 目前常規治療方法大多為手術、 放療、 化療等, 但常出現術后復發和轉移、 對放療不敏感、 化療抵抗性等現象, 臨床療效不理想[1], 故尋找安全有效的治療方法和新藥成為近年來研究的熱點。 目前, 中藥及其提取物治療癌癥備受關注[2]。

異甘草素是從甘草中提取出的一種異黃酮類成分, 具有抗氧化、 抗炎、 抗腫瘤作用, 并能擴張動脈, 起到保護心臟、 大腦的作用[3], 可抑制多種消化道腫瘤活性, 如結腸癌、 胃癌等[4], 但其在結直腸癌中抗癌機制目前尚不清楚。 MAPK/ERK信號通路在多種細胞中具有調控細胞增殖、 凋亡、分化、 侵襲、 遷移等非常重要的作用[5-6]。 研究表明在結直腸癌發生發展過程中與MAPK/ERK 信號通路異常激活密切相關[7], 在肝細胞中異甘草素可通過調控MAPK/ERK、 JNK/MAPK 等信號通路激活來發揮抗炎作用[8]。 因此, 本實驗探討異甘草素對結直腸癌細胞、 MAPK/ERK 信號通路的影響, 以期研究其作用機制。

1 材料

異甘草素（含有量大于98%）、 二甲基亞砜購自美國Sigma 公司； 人結直腸癌細胞株HCT116、HT29 購自中國科學院昆明動物研究所； RPMI 1640 培養基、 胎牛血清、 胰蛋白酶、 青霉素、 鏈霉素購自美國Gibco 公司； Matrigel 購自美國BD 公司； Transwell 小室購自美國Corning 公司； MTT 檢測試劑盒、 細胞蛋白裂解液購自上海碧云天生物工程有限公司； Trizol 試劑購自美國Invitrogen 公司；Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒購自日本TaKaRa 公司； BCA 蛋白定量試劑盒、 ELC 發光檢測試劑盒購自美國CST 公司； cleaved caspase-3、pJNK、 JNK、 pERK1/2、 ERK1/2、 pP38、 P38 抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗購自美國Novus Biologicals 公司。

2 方法

2.1 細胞培養 HCT116、 HT29 細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養基（含1% 青霉素、 鏈霉素雙抗） 中, 置于37 ℃、 5%CO2培養箱中培養。

2.2 細胞毒性檢測 采用MTT 法。 收集處于對數生長期的HCT116、 HT29 細胞, 以完全培養基將細胞密度調整為5×105/mL, 在96 孔細胞培養板中每孔接種200 μL 細胞, 置于37 ℃培養箱中繼續培養, 待細胞貼壁后加入含異甘草素10、 20、 40、60、 80、 100、 120 μmol/L 的培養基, 對照組加入等量培養基, 每個濃度設置3 個復孔。 異甘草素處理48 h 后, 添加20 μL MTT 溶液, 置于37 ℃培養箱中繼續孵育4 h, 除去培養液后再加入150 μL 二甲基亞砜, 避光充分混勻, 振蕩反應至結晶紫完全溶解, 于570 nm 波長處測定光密度（OD） 值, 計算抑制率, 公式為抑制率= [（1-實驗組OD 值/對照組OD 值） ] ×100%, 再計算IC50值。

2.3 HCT116 細胞凋亡檢測 采用流式細胞術。取對數生長期的HCT116 細胞, 0.25%胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液, 接種于6 孔板中, 密度1×104/mL, 置于37 ℃培養箱中繼續培養, 細胞貼壁后分別加入含異甘草素10、 15、 20 μmol/L 的培養基, 對照組加入等量培養基, 各組細胞培養48 h后通過Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡率。 收集各組處理后的細胞, PBS 洗滌2 次,約400 μL 結合緩沖液混勻, 再依次加入Annexin VFITC、 PI 各5 μL, 室溫下避光孵育15 min, 流式細胞儀測定HCT116 細胞凋亡率。

2.4 HCT116 細胞中蛋白表達水平檢測 采用Western blot 法。 將HCT116 細胞以5×104/mL 的密度接種于6 cm 培養皿中, 置于37 ℃培養箱中培養24 h, 將終濃度10、 15、 20 μmol/L 的異甘草素加到培養基中繼續培養48 h, 收集細胞, 加入細胞裂解液, 冰上裂解30 min, 離心并提取細胞總蛋白。BCA 試劑盒對所提取的蛋白進行定量測定, 取35 μg 總蛋白進行10% SDS-PAGE 電泳, 半干法將凝膠上的蛋白轉移至PVDF 膜上, 將膜加到含5%脫脂奶粉的封閉液中封閉4 h, 依次加入一抗cleaved caspase-3 （1 ∶1 000 倍稀釋）、 pJNK （1 ∶800 倍稀釋）、 JNK （1 ∶800 倍稀釋）、 pERK1/2 （1 ∶500倍稀釋）、 ERK1/2 （1 ∶500 倍稀釋）、 pP38 （1 ∶1 000 倍稀釋）、 P38 （1 ∶1 000 倍稀釋）, 4 ℃下孵育過夜, TBST 洗滌3 次, 加入二抗（1 ∶3 000倍稀釋）, TBST 洗滌3 次后, ECL 化學發光試劑盒進行發光, 轉移至暗室中, 在成像儀中曝光拍照,以GAPDH 為內標, 通過Image J 圖像分析系統分析各條帶灰度值, 以相對灰度值表示待測蛋白cleaved caspase-3、 pJNK、 JNK、 pERK1/2、 ERK1/2、 pP38、 P38 蛋白相對表達。

2.5 HCT116 細胞遷移、 侵襲檢測 采用Transwell 實驗。 在冰上以不含血清的培養基稀釋Matrigel 膠, 將稀釋好的基質膠以每孔40 μL 的密度鋪于Transwell 小室的上室中, 將小室放到24 孔板中, 置于37 ℃培養箱中靜置, 待基質膠完全風干后取出。 將各組HCT116 細胞饑餓24 h, 0.25%胰蛋白酶消化, PBS 洗滌3 次, 無血清培養基重懸細胞, 制成單細胞懸液。 在Transwell 上室加入200 μL細胞懸液（密度為2×105/mL）, Transwell 下室中加入含終濃度0、 10、 15、 20 μmol/L 異甘草素的培養基（含10%胎牛血清）, 置于37 ℃培養箱中孵育48 h。 取出Transwell 小室, 吸去上室液體,棉簽擦去上室未侵襲的細胞, 在Transwell 小室的下室加入500 μL 甲醇固定15 min, 0.1%結晶紫染色15 min, 去離子水洗滌數次后晾干, 倒置顯微鏡下隨機選取5 個視野, 拍照, 計數, 以穿膜細胞數表示HCT116 細胞侵襲能力； Transwell 上室不加Matrigel 基質膠涂層以檢測細胞遷移能力, 步驟同上, 并以穿膜細胞數表示HCT116 細胞遷移能力。

2.6 統計學處理 通過SPSS 21.0 軟件進行處理,多組差異比較采用單因素方差分析, 組間差異比較采用SNK-q 檢驗。 以P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 異甘草素對HCT116、 HT29 細胞的毒性 圖1 顯示, 不同濃度異甘草素處理48 h 后, 隨著其濃度增加對HCT116、 HT29 細胞增殖的抑制率逐漸升高, 在10 ～120 μmol/L 范圍內表現出明顯的細胞毒性作用, 并呈濃度依賴性, 對兩者的IC50分別為22.45、 23.69 μmol/L。 本 實 驗 選 擇10、 15、20 μmol/L 異甘草素作用于HCT116 細胞, 進行后續研究。

圖1 異甘草素對各細胞的毒性Fig.1 Toxicities of isoglycyrrhizin on various cells

3.2 異甘草素對HCT116 細胞凋亡的影響 圖2顯示, 與對照組比較, 異甘草素組cleaved caspase-3 蛋白表達顯著升高（P＜0.05）； 與對照組比較,異甘草素組細胞凋亡率顯著增加（P＜0.05）, 并呈濃度依賴性。

3.3 異甘草素對HCT116 細胞遷移、 侵襲的影響圖3 顯示, 與對照組比較, 異甘草素組細胞遷移、 侵襲能力顯著下降（P＜0.05）。

3.4 異甘草素對HCT116 細胞中MAPK/ERK 信號通路的影響 圖4 顯示, 隨著異甘草素濃度增加,pJNK、 pERK1/2、 pP38 水 平 逐 漸 降 低, pJNK/JNK、 pERK1/2/ERK1/2、 pP38/P38 比值亦然, 與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

4 討論

結直腸癌發病率、 死亡率在世界各國均較高,是影響人類健康和生命的高發性惡性腫瘤之一。 患者死亡率較高的主要原因是復發和遠端轉移, 故能有效抑制結直腸癌細胞增殖、 轉移是關鍵所在[9]。異甘草素是甘草中含有量較高的一種黃酮類成分,具有廣泛的抗病毒、 抑制脂質過氧化、 抗自由基、抗炎、 抗腫瘤等活性, 而且不良反應較少[10], 另外甘草酸、 甘草次酸、 甘草苷也有一定活性[11],該成分可通過靶向調控表皮生長因子受體, 抑制肺癌細胞增殖[12]； 下調細胞血管內皮生長因子表達,抑制乳腺癌誘導的血管生成[13]； 抑制JNK/AP-1信號通路激活, 抑制前列腺癌細胞的侵襲能力[14]；降低miR-374a 表達, 抑制異常Akt 信號傳導, 從而增加PTEN 表達, 并抑制乳腺癌細胞增殖和轉移[15]。 近期研究顯示, 異甘草素能通過下調環氧合酶-2 和一氧化氮合酶的表達來阻礙結腸癌發生[16]； 本實驗以不同濃度異甘草素干預人結直腸癌細胞, 發現該成分能呈濃度依賴性地抑制結直腸癌細胞的增殖、 轉移和侵襲, 并誘導細胞發生凋亡。

caspase-3 作為凋亡執行蛋白, 在細胞凋亡過程中發揮關鍵作用。 研究表明, 異甘草素能調控肝癌細胞、 腦膠質瘤干細胞、 黑色素瘤細胞中caspase-3 活性, 上調cleaved caspase-3 表達, 誘導細胞凋亡[17-19]； 本實驗發現, 異甘草素干預結直腸癌HCT116 細胞后, cleaved caspase-3 表達增強,表明該成分可通過上調其表達來促進結直腸癌細胞凋亡。

圖2 異甘草素對HCT116 細胞凋亡的影響Fig.2 Effects of isoglycyrrhizin on HCT116 cell apoptosis

注： ISL 為異甘草素。 與對照組比較,*P＜0.05

圖4 異甘草素對MAPK/ERK 信號通路的影響Fig.4 Effects of isoglycyrrhizin on MAPK/ERK signaling pathway

MAPK/ERK 信號通路參與多種腫瘤細胞增殖、分化、 凋亡、 侵襲、 轉移等, 包括JNK、 ERK1/2、P38 等關鍵分子, 當這些分子發生磷酸化后可調控相關基因的表達, 進而影響細胞周期、 cleaved caspase-3、 基質金屬蛋白酶等表達, 介導細胞發生增殖、 凋亡、 轉移等過程[20]。 研究表明, 甘草苷能通過調節ERK1、 ERK2 及ERK1/2、 MEK-2 等表達來調控MAPK/ERK 信號通路激活水平, 抑制子宮腺肌病病灶細胞的異常增殖, 減緩子宮腺肌病進展[21]； 異甘草素能下調PIK3/Akt 和P38MAPK 信號轉導通路活性, 抑制細胞中基質金屬蛋白酶MMP-2、 MMP-9 表達, 以及乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲能力[22], 同時通過細胞外信號ERK 調節激酶介導的誘導抗氧化基因Nrf2 的激活, 從而起到肝臟保護作用[23], 還能通過抑制ERK1/2、 p38磷酸化來抑制MAPK 信號轉導途徑活化, 改善葡聚糖硫酸鈉誘導的結腸炎[24]。 本實驗以不同濃度異甘草素處理HCT116 細胞后, 經Western blot 檢測發現JNK、 ERK1/2、 P38 磷酸化水平明顯降低,表明該成分通過抑制MAPK/ERK 信號通路激活來抑制結直腸癌細胞的增殖、 侵襲和遷移, 并誘導細胞凋亡, 與Hu 等[25]報道一致。

綜上所述, 異甘草素可抑制結直腸癌細胞的增殖、 侵襲和遷移, 誘導細胞發生凋亡, 其作用機制可能與抑制JNK、 ERK1/2、 P38 磷酸化水平及MAPK/ERK 信號通路激活有關。 本實驗可為尋找異甘草素防治結直腸癌的潛在藥物靶點提供依據,但仍需后續研究作支持。