芪藶強心膠囊中生物堿在大鼠體內的藥動學行為

張 瑜， 張富賡， 朱明丹， 張少強， 杜武勛*， 肖學鳳*

（1. 天津中醫藥大學， 天津301617； 2. 天津市環湖醫院， 天津300350； 3. 天津中醫藥大學第二附屬醫院， 天津300150）

慢性心力衰竭是各種心血管疾病的終末階段和主要死因之一, 其發病涉及多個組織、 器官系統的病理損害, 是21 世紀心血管領域主要挑戰之一[1]。芪藶強心膠囊首次收載于2015 年版《中國藥典》中, 由黃芪、 附子、 人參、 丹參、 葶藶子等11 味中藥組成, 具有益氣溫陽、 活血通絡、 利水消腫的功效, 能提高慢性心力衰竭患者運動耐性和生活質量, 可作為治療慢性心力衰竭的聯合用藥[2], 附子作為方中君藥, 對患者血流動力學改變和心室重構具有保護作用[3], 其主要成分二萜類生物堿既是藥效成分, 又是毒性成分[4], 雙酯型生物堿（烏頭堿、 新烏頭堿、 次烏頭堿） 對心臟的毒性作用表現為致心肌細胞凋亡、 致心律失常和低血壓等[5-7], 但該成分在低濃度時對心肌細胞也有保護作用[8], 而水解去掉一個酰基后轉化成單酯型生物堿（苯甲酰烏頭原堿、 苯甲酰新烏頭原堿、 苯甲酰次烏頭原堿）, 毒性降低, 生物活性減弱[9-10]。因此, 分析芪藶強心膠囊中生物堿的體內代謝過程時, 對保證藥物安全性和有效性具有重要意義。

課題組前期已對芪藶強心膠囊中生物堿進行定量研究, 本實驗在此基礎上建立HPLC-MS/MS 法測定血漿中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、 苯甲酰新烏頭原堿、 苯甲酰次烏頭原堿血藥濃度, 并研究大鼠灌胃給藥后上述成分的藥動學行為, 以期為闡釋藥物體內過程、篩選藥效物質、臨床合理用藥提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器 LC-20A 液相色譜儀, 配置SIL-20AC恒溫自動進樣器、 CBM-20A 控制器、 CTO-20A 柱溫箱、 Analyst Software 色譜工作站（1.5.2 版本）、島津LC-20AD 泵（日本島津公司）； API4000Qtrap質譜儀（美國應用生物系統公司）； MIKRO220R型低溫高速離心機（德國Hettich 公司）； Sorvall RC-6Plus 離心機 （美國Thermo Scientific 公司）；Targin VX-02 多管渦旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司）； XS205 電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司]。

1.2 試藥 芪藶強心膠囊（烏頭堿0.003 mg/g、新烏頭堿0.003 mg/g、 次烏頭堿0.004 mg/g、 苯甲酰烏頭原堿0.023 mg/g、 苯甲酰新烏頭原堿1.072 mg/g、 苯甲酰次烏頭原堿0.896 mg/g） 由石家莊以嶺藥業股份有限公司提供 （批號140805）。 次 烏 頭 堿 （110798-201308, 含 有 量98.6%）、 新 烏 頭 堿 （110799-201307, 含 有 量98.3%）、 苯甲酰烏頭原堿（111794-201304, 含有量97.5%）、 苯甲酰次烏頭原堿（111796-201304,含有量94.6%）、 苯甲酰新烏頭原堿 （111795-201303, 含 有 量 96.3%）、 丁 螺 環 酮 （內 標,101059-201101, 含有量99.8%） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院； 烏頭堿（P23S7F21639,含有量≥98.0%） 對照品購自上海源葉生物科技有限公司。 甲醇為色譜純； 醋酸銨、 甲酸為分析純；水為超純水。

1.3 動物 健康雄性SD 大鼠, 體質量（220±20） g,由解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供, 在天津中醫藥大學動物房內飼養, 溫度（22±2）℃, 濕度（50±10）%, 適應性喂養1 周后進行實驗, 研究經天津中醫藥大學倫理委員會批準。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent ZOBRAX XDB-C18色譜柱（4.6 mm×50 mm, 3.5 μm）； 以水（含5 mmol/L醋酸銨） （A） -甲醇（0.1%甲酸） （B） 為流動相, 梯度洗脫 （0.01 ～1 min, 2% B； 1 ～2 min,2% ～60% B； 2 ～3 min, 60% ～98% B； 3 ～4 min,98%B； 4～4.01 min, 98% ～2%B； 4.01 ～5.5 min,2%B）； 體積流量0.45 mL/min； 柱溫40 ℃； 進樣量10 μL。

2.2 質譜條件 電噴霧離子源（ESI）, 正離子模式下檢測, 掃描方式為多反應監測（MRM）； 氣簾氣（CUR） 體積流量20 L/min； 噴霧電壓（IS）5 000 V； 離子源溫度 （TEM） 550 ℃； 霧化氣（GAS1） 體積流量60 L/min； 加熱輔助氣（GAS2）體積流量55 L/min。 質譜參數見表1。

表1 各生物堿質譜參數Tab.1 MS parameters for various alkaloids

2.3 溶液制備

2.3.1 對照品溶液 精密稱取烏頭堿、 新烏頭堿、次烏頭堿、 苯甲酰烏頭原堿、 苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿對照品適量, 二甲基亞砜（DMSO） 溶解配制成2.00 mg/mL, 精密量取適量, 甲醇-水（1 ∶1） 稀釋, 即得（分別含烏頭堿、 新烏頭堿、 次烏頭堿、 苯甲酰次烏頭原堿0.1、 0.2、0.5、 1、 2、 5、 20、 50、 100、 200 ng/mL, 苯甲酰烏頭原堿、 苯甲酰新烏頭原堿0.25、 0.5、 1.25、2.5、 5、 12.5、 50、 125、 250、 500 ng/mL）。

2.3.2 內標溶液 精密稱取丁螺環酮對照品適量,甲醇-乙腈（1 ∶1） 溶解搖勻, 即得（20 ng/mL）,置于4 ℃下保存備用。

2.4 血漿處理 取血漿50 μL, 加入濃氨水溶液（濃氨水∶水=1 ∶1） 10 μL、 內標溶液10 μL、 乙酸乙酯500 μL, 渦旋2 min, 15 000 r/min 離心10 min, 取上清液400 μL, 氮氣吹干, 測定前以100 μL 50%甲醇復溶, 在“2.1” “2.2” 項條件下進樣10 μL 測定。

2.5 方法學考察

2.5.1 專屬性試驗 取空白血漿（等體積甲醇代替內標溶液）、 空白血漿+對照品（烏頭堿、 新烏頭堿、 次烏頭堿、 苯甲酰次烏頭原堿質量濃度為0.01 ng/mL, 苯甲酰烏頭原堿、 苯甲酰新烏頭原堿質量濃度為0.025 ng/mL）、 灌胃給藥（1.3 g/kg）后20 min 大鼠血漿, 按“2.4” 項下方法處理, 在“2.1” “2.2” 項條件下進樣測定, 結果見圖1。 由圖可知, 烏頭堿、 新烏頭堿、 次烏頭堿、 苯甲酰烏頭原堿、 苯甲酰新烏頭原堿、 苯甲酰次烏頭原堿、丁螺 環 酮 保 留 時 間 分 別 為3.71、 3.68、 3.73、3.60、 3.53、 3.63、 3.58 min, 生物堿和內標能完全分離, 不受血漿中雜質、 內源性物質干擾, 方法專屬性良好。

圖1 各生物堿MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of various alkaloids

2.5.2 線性關系考察 取大鼠空白血漿50 μL,加入對照品溶液, 得到烏頭堿、 新烏頭堿、 次烏頭堿、 苯甲酰次烏頭原堿質量濃度為0.01、 0.02、0.05、 0.1、 0.2、 0.5、 2、 5、 10、 20 ng/mL, 苯甲酰烏頭原堿、 苯甲酰新烏頭原堿質量濃度為0.025、 0.05、 0.125、 0.25、 0.5、 1.25、 5、12.5、 25、 50 ng/mL。 按“2.4” 項下方法處理,在“2.1” “2.2” 項條件下進樣測定。 以溶液質量濃度為橫坐標（X）, 對照品與內標峰面積比值為縱坐標（Y） 進行回歸, 結果見表2, 可知各生物堿在各自范圍內線性關系良好。

表2 各生物堿線性關系Tab.2 Linear relationships of various alkaloids

2.5.3 精密度、 準確度試驗 取大鼠空白血漿, 加入低、 中、 高質量濃度對照品溶液, 得到含烏頭堿（0.02、 0.5、 16 ng/mL）、 新烏頭堿（0.02、 0.5、16 ng/mL）、 次烏頭堿（0.02、 0.5、 16 ng/mL）、 苯甲酰烏頭原堿（0.05、 1.25、 40 ng/mL）、 苯甲酰新烏頭原堿（0.05、 1.25、 40 ng/mL）、 苯甲酰次烏頭原堿（0.02、 0.5、 16 ng/mL） 的質控樣品, 按“2.4” 項下方法處理, 在“2.1” “2.2” 項條件下進樣測定, 于同1 d 內連續進行6 次, 計算日內精密度； 連續進行3 d, 計算日間精密度, 結果見表3, 可知該方法精密度、 準確度良好。

表3 各生物堿精密度、 準確度、 基質效應、 提取回收率試驗結果（n=6）Tab.3 Results of precision， accuracy， matrix effect and extraction recovery tests for various alkaloids （n=6）

2.5.4 提取回收率、 基質效應 取“2.5.3” 項下質控樣品, 每個質量濃度平行6 份, 按“2.4”項下方法處理, 在“2.1” “2.2” 項條件下進樣測定, 得到成分峰面積（A）； 以甲醇代替空白血漿,其余操作同上, 得到成分峰面積（B）； 取大鼠空白血漿, 按“2.4” 項下方法處理后加入質控樣品, 在“2.1” “2.2” 項條件下進樣測定, 得到成分峰面積（C）, 以A、 B 比值計算基質效應, A、C 比值計算提取回收率, 結果見表3, 可知大鼠血漿中內源性物質對檢測無影響, 提取回收率符合相關要求。

2.5.5 穩定性試驗 取“2.5.3” 項下質控樣品,考察凍融穩定性（-20 ℃下凍融3 次）、 處理后穩定性（自動進樣器中放置24 h）、 短期穩定性（室溫下放置24 h）、 長期穩定性 （-80 ℃下放置30 d）, 結果見表4, 可知穩定性良好。

2.6 藥動學行為研究 取6 只大鼠, 實驗前禁食12 h, 自由飲水, 灌胃給予1.3 g/kg 藥物混懸液（0.5% CMC-Na 配制）, 于給藥后0.083、 0.167、0.333、 0.667、 1、 1.5、 2、 3、 4、 6、 8、 12、24 h經目內眥靜脈叢取血0.5 mL, 樣品置于肝素鈉抗凝管中, 4 ℃、 12 000 r/min 下離心10 min,分離血漿, 置于-20 ℃冰箱中待測, 血藥濃度-時間曲線見圖2, 再通過DAS 3.0 軟件計算藥動學參數, 結果見表5。 由此可知, 灌胃給藥后血漿中附子主要生物堿（烏頭堿、 新烏頭堿、 次烏頭堿、 苯甲酰烏頭原堿、 苯甲酰新烏頭原堿、 苯甲酰次烏頭原堿）均能檢測到, 其中新烏頭堿最快達峰, 其次是烏頭堿和次烏頭堿, 再次是苯甲酰新烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿, 苯甲酰烏頭原堿最慢； 苯甲酰新烏頭原堿達峰血藥濃度（Cmax） 和藥時曲線下面積（AUC0～t） 明顯高于其他成分； 烏頭堿、 苯甲酰烏頭原堿、 苯甲酰次烏頭原堿半衰期（t1/2） 較長, 而新烏頭堿、 次烏頭堿、 苯甲酰新烏頭原堿相對較短。

表4 各生物堿穩定性試驗結果（n=6）Tab.4 Results of stability tests for various alkaloids （n=6）

圖2 各生物堿血藥濃度-時間曲線Fig.2 Plasma concentration-time curves for various alkaloids

表5 各生物堿藥動學參數（n=6）Tab.5 Pharmacokinetic parameters for various alkaloids （n=6）

3 討論

復方中藥藥動學研究是中醫藥現代化的核心,也是中藥藥效物質基礎、 活性成分體內過程、 藥動-藥效相關性等研究領域的重要組成部分, 可為臨床合理用藥和安全性評價提供實驗依據[11-12]。芪藶強心膠囊作為首個經循證醫學證實的對慢性心力衰竭確有療效的中成藥[13], 其藥效物質基礎研究和安全性探討仍是需要解決的關鍵問題, 附子作為該制劑君藥占復方總量的5.929%[14], 其主要藥效成分生物堿也是毒性成分, 故研究大鼠灌胃給藥后雙酯型生物堿（烏頭堿、 新烏頭堿、 次烏頭堿）和單酯型生物堿（苯甲酰烏頭原堿、 苯甲酰新烏頭原堿、 苯甲酰次烏頭原堿） 血藥濃度和藥動學行為時, 能為芪藶強心膠囊的臨床合理應用和安全性監控提供依據。

前期研究表明[15], 芪藶強心膠囊中單酯型生物堿總平均含有量是雙酯型生物堿的199.1 倍, 本實驗在此基礎上對其體內代謝過程進行分析, 發現后者在大鼠體內吸收速度快于前者； AUC 反映藥物進入人體循環的相對量, 是衡量藥物利用程度的重要參數[16], 本實驗表明苯甲酰烏頭原堿、 苯甲酰新烏頭原堿的AUC0～∞明顯高于雙酯型生物堿,這可能與其含有量有關[15], 但單酯型生物堿平均AUC0～∞僅是雙酯型生物堿的1.86 倍, 提示后者在正常機體內的吸收情況優于前者。

4 結論

本實驗建立HPLC-MS/MS 法測定大鼠灌胃芪藶強心膠囊后雙酯型生物堿（烏頭堿、 新烏頭堿、次烏頭堿）、 單酯型生物堿（苯甲酰烏頭原堿、 苯甲酰新烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿） 血藥濃度,經方法學考察發現該方法符合生物樣品測定要求,可用于生物體內藥動學研究； 雙酯型生物堿在大鼠體內吸收速度和吸收程度明顯優于單酯型生物堿,可為指導該制劑臨床合理用藥、 保證有效性和安全性提供科學依據。