胱天蛋白酶14在慢性光化性皮炎患者皮損中的表達及中波紫外線對其mRNA和蛋白在HaCaT細胞中表達的影響

李凌佳 劉彤云

昆明醫科大學第一附屬醫院皮膚科 650032

李凌佳現在無錫市第二人民醫院皮膚科，江蘇 214000

慢性光化性皮炎（chronic actinic dermatitis，CAD）發病機制至今尚未完全清楚，光照是其主要誘發因素。中波紫外線（UVB）可使機體載體蛋白結構發生改變，參與免疫調節反應，破壞皮膚屏障，從而導致CAD發病［1］。胱天蛋白酶14（caspase-14）主要分布于已分化的角質形成細胞內，發揮皮膚屏障功能［2］。Devos 等［3］發現，caspase-14 缺陷小鼠給予UVB 照射后，照光部位皮膚環丁烷嘧啶二聚體較野生型小鼠增加了2 倍，并證實聚絲蛋白（filaggrin）的正常水平及其caspase-14 相關的降解機制的正常運轉對于保護皮膚免受有害的UVB輻射具有重要作用。已有文獻證實，caspase-14 在銀屑病、特應性皮炎、皮膚腫瘤中表達下調［4-6］，但在CAD中表達情況尚不清楚。我們觀察了caspase-14在CAD 皮損中的表達，并評估UVB 對HaCaT 細胞caspase-14 mRNA 和蛋白表達的影響。5-AzaC 為甲基化酶抑制劑，誘導去甲基化和基因活化，常用于DNA 甲基化水平的研究，本研究中我們擬加入 5-AzaC 干預，初步探討 UVB 對 HaCaT 細胞caspase-14 表達的影響是否與DNA 甲基化狀態的改變有關。

對象與方法

一、對象

收集2016年在昆明醫科大學第一附屬醫院皮膚科門診就診的10 例CAD 患者，均經臨床、組織病理學和光生物學試驗確診，男8 例，女2 例，年齡52 ～72（59.6 ±10.4）歲，病程2 ～20年。10例2016年在昆明醫科大學第一附屬醫院皮膚科就診的濕疹患者作為陽性對照，其中男6 例，女4 例，年齡46 ～74（61.2 ± 9.6）歲；10 例健康對照來自外科整形手術取材的正常皮膚，其中男5 例，女5 例，年齡48 ～68（58.2 ± 11.3）歲。3 組受試者性別、年齡差異無統計學意義（均P＞ 0.05）。

二、方法

1.標本獲取：局麻下行手術取材。在面、頸或手背曝光部位，常規手術切取0.5 cm×1 cm皮膚標本，用4%中性甲醛固定，常規脫水、石蠟包埋。

2.細胞、主要試劑和儀器：HaCaT 細胞株為本實驗室保存；南美胎牛血清、DMEM 培養基（美國Hyclone公司）；鼠抗caspase-14蛋白多克隆抗體、兔抗β 肌動蛋白單克隆抗體（美國Abcam 公司）。UVB 輻照計為上海希格瑪高科技有限公司產品，光源使用Philips 公司寬譜UVB 低壓燈管（PL-S 9W/12），波長280～320 nm。

3.皮膚組織HE 染色和免疫組化：常規HE 染色。免疫組化染色按照染色試劑盒（福州邁新生物技術開發公司）操作說明進行，所有切片均在同一質控條件下操作，設陽性和陰性對照。結果判斷：細胞質和/或細胞核中出現棕黃色或褐色顆粒為caspase-14 陽性。在陽性細胞密度高的區域選取5個高倍視野（×400），通過觀察視野內棕黃色或褐色著色的強弱及陽性細胞比例評分。顏色強弱評分：無顏色改變為0分，淺黃色1分，淺褐色2分，褐色3 分。陽性細胞比例評分：陽性細胞比例＜5%為0 分，5% ～ ＜ 25%為1 分，25% ～ ＜ 50%為2 分，50%～＜75%為3分，≥75%為4分。2項評分相加，并分為 4 個等級，0 ～ 1 分為-，2 分為+，3 ～ 4 分++，≥5 分為+++。評分由2 名病理科醫生采用雙盲原則判定，達到++與+++為陽性。

4.HaCaT細胞培養及處理：HaCaT細胞常規培養在含10%胎牛血清的DMEM 培養基中，待細胞貼滿瓶壁時用0.25%的胰酶消化傳代培養。取第3 ～8 代細胞，當細胞處于90%融合狀態時將細胞按 50 萬個/孔接種于 6 孔板，分別給予 0、30、60、90 mJ/cm2UVB 照射，然后每種UVB 照射劑量孔分別加入0、1.25、2.5、5.0 μmol/L 5-AzaC，每個劑量、濃度均設3 個復孔，繼續培養24 h 后噻唑藍法（MTT）檢測不同處理條件下細胞增殖活性（A490）。

5.HaCaT細胞caspase-14 mRNA表達及蛋白水平檢測：HaCaT 細胞培養、傳代，當細胞處于90%融合狀態時，將細胞按50萬個/孔接種于6孔板，分為 4 組，分別給予 0、30、60、90 mJ/cm2UVB 照射，每個UVB劑量組再分成兩組，一組加入2.5 μmol/L 5-AzaC，一組不加5-AzaC（對照組），每種處理設3個復孔，24 h后終止培養，進行以下試驗。

（1）qRT-PCR 檢測caspase-14 mRNA 表達：采用Trizol 法，按照說明書步驟提取HaCaT 細胞RNA，采用RT-PCR 對目標基因進行定量分析，操作按試劑盒說明書進行。caspase-14、β 肌動蛋白引物（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用20 μl 反應體系，95 ℃預變性10 min，95 ℃變性 45 s，60 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 20 s，共40 個循環。以 β 肌動蛋白為內參照，以 2-△△Ct法計算caspase-14 mRNA相對表達量。

表1 caspase-14基因與內參基因引物序列

（2）Western印跡法檢測HaCaT細胞caspase-14蛋白表達：收集HaCaT細胞，常規提取蛋白并定量，凝膠電泳，硝酸纖維素膜轉膜，5%脫脂牛奶液室溫封閉1 h。分別加入鼠抗caspase-14 蛋白多克隆抗體、兔抗β 肌動蛋白單克隆抗體，4 ℃孵育過夜，TBST 液洗膜3次，每次10 min。加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠或羊抗兔IgG，室溫孵育1 h，TBST液洗膜3次。化學發光法檢測目的條帶，用ImageJ軟件分析條帶的灰度值，目的條帶與內參β肌動蛋白條帶的灰度值比值為caspase-14 蛋白相對表達水平。

6.統計學方法：采用SPSS22.0 軟件，陽性率的比較采用卡方檢驗；計量資料采用表示，組間均數比較使用t檢驗和雙因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、caspase-14在CAD患者皮損中的表達

正常組織、CAD 及濕疹皮損均表達caspase-14蛋白。正常組織主要表達在基底層上方和毛囊、皮脂腺等附屬器中，且角質層表達顯著；在CAD和濕疹皮損中caspase-14表達在顆粒層和棘層，而角質層不表達。見圖1。

CAD 與濕疹皮損比較，caspase-14 陽性比例差異無統計學意義（χ2=2.41，P＞ 0.05）。CAD皮損中caspase-14 陽性比例低于正常組織，差異有統計學意義（χ2=7.30，P＜ 0.05）。見表2。

圖1 caspase-14在正常皮膚、慢性光化性皮炎與濕疹皮損中的表達（免疫組化×200） caspase-14在正常皮膚組織基底層上方、毛囊、皮脂腺等附屬器中表達，且角質層表達顯著。慢性光化性皮炎、濕疹皮損中caspase-14表達在顆粒層和棘層，而角質層不表達

二、不同劑量5-AzaC干預對HaCaT細胞增殖的影響

MTT 結果顯示，不同UVB 照射劑量間細胞增殖活性差異有統計學意義（F=46.09，P＜ 0.05）；加入5-AzaC 干預后，不同濃度5-AzaC 間細胞增殖活性差異無統計學意義（F=1.52，P＞ 0.05），取中間濃度2.5 μmol/L進行后續實驗。見表3。

三、不同劑量UVB照射對HaCaT細胞caspase-14 mRNA、蛋白表達的影響

qRT-PCR 與Western 印跡檢測結果顯示，不同劑量UVB 照射后caspase-14 mRNA、蛋白的表達差異均有統計學意義（均P＜0.05），caspase-14 mRNA、蛋白的表達隨UVB 劑量升高有下降趨勢；UVB 劑量為 0、30、60、90 mJ/cm2時，5-AzaC 組caspase-14 mRNA、蛋白的表達均高于對照組（均P＜ 0.05）。見表4，圖2。

表2 caspase-14在正常皮膚、慢性光化性皮炎、濕疹皮損中的表達

表3 中波紫外線（UVB）與甲基化酶抑制劑（5-AzaC）干預對HaCaT細胞增殖活性（A490）的影響（，n=3）

表3 中波紫外線（UVB）與甲基化酶抑制劑（5-AzaC）干預對HaCaT細胞增殖活性（A490）的影響（，n=3）

5-AzaC濃度（μmol/L）0 1.25 2.5 5.0 UVB劑量（mJ/cm2）0 1.09±0.06 1.11±0.04 1.12±0.05 1.11±0.02 30 0.81±0.05 0.79±0.03 0.93±0.06 1.02±0.03 60 0.53±0.02 0.58±0.06 0.56±0.08 0.52±0.04 90 0.31±0.03 0.36±0.04 0.44±0.03 0.42±0.04

討 論

caspase-14 在角質層表達活躍，主要在角質形成細胞分化終末階段表達，促進表皮成熟、防御紫外線損傷及水分丟失［2］。既往研究發現，銀屑病患者皮損中caspase-14表達降低［4］，caspase-14基因敲除小鼠較正常小鼠更容易被誘發銀屑病［7］，特應性皮炎皮損中幾乎無caspase-14表達，其周圍正常區域皮膚caspase-14亦顯著降低［8］。

我們通過免疫組化發現，caspase-14 在正常皮膚組織主要表達在基底層上方、毛囊、皮脂腺等附屬器中，且角質層表達顯著，在CAD和濕疹皮損中表達在顆粒層和棘層，而角質層不表達，這與Alibardi 等［9］以銀屑病作為研究對象的結果相似。Marsella 等［2］建立犬特應性皮炎模型，取病變組織進行免疫組化檢測，結果顯示，caspase-14 表達降低。Walsh等［4］指出，caspase-14在正常組織的細胞質和細胞核均表達，在銀屑病中表達顯著降低，基本位于胞質，核染色很弱甚至消失。我們的實驗結果亦顯示，caspase-14 在正常組織顯著表達，而在CAD 皮損表達降低，主要位于胞質，少量表達在胞核。caspase-14在濕疹、銀屑病、CAD和特應性皮炎中均表達異常，提示其對維持正常皮膚屏障功能的完整性具有重要意義，可能參與CAD的發病。

圖2 Western印跡法檢測中波紫外線（UVB）照射與甲基化酶抑制劑（5-AzaC）對HaCaT細胞caspase-14蛋白表達的影響

表4 不同劑量中波紫外線（UVB）照射與2.5 μmol/L甲基化酶抑制劑（5-AzaC）對HaCaT細胞caspase-14 mRNA及蛋白相對表達水平的影響（）

表4 不同劑量中波紫外線（UVB）照射與2.5 μmol/L甲基化酶抑制劑（5-AzaC）對HaCaT細胞caspase-14 mRNA及蛋白相對表達水平的影響（）

注：n=3。a 與不照射UVB組比較，P ＜ 0.05

組別UVB劑量（mJ/cm2）0 F值P值306090 mRNA表達（2-△△Ct）不加5-AzaC組（對照組）5-AzaC組t值P值蛋白表達不加5-AzaC組（對照組）5-AzaC組t值P值1.00±0.16 1.35±0.14 9.47＜0.05 0.67±0.12a 0.73±0.21 4.58＜0.05 0.51±0.22a 0.54±0.11 2.16＜0.05 0.27±0.13a 0.45±0.19 8.34＜0.05 87.54＜0.05 1.71±0.27 1.87±0.10 7.18＜0.05 1.59±0.22a 1.61±0.15a 1.42＜0.05 1.44±0.14a 1.57±0.21a 5.61＜0.05 1.36±0.17a 1.42±0.09a 2.37＜0.05 23.46＜0.05

Devos 等［3］報道，特應性皮炎小鼠模型受到UVB照射時，隨著照射劑量增加，caspase-14表達水平下降。我們發現，隨著UVB 照射劑量增加，HaCaT 細胞caspase-14 mRNA 和蛋白表達水平下調，提示UVB 可以降低caspase-14 的表達，從而誘發或加重CAD。加入5-AzaC后與僅UVB照射時相比，HaCaT 細胞caspase-14 mRNA 和蛋白表達水平升高。推測UVB照射有可能通過影響DNA甲基化狀態從而影響caspase-14 的表達。但其具體機制有待進一步探討。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突