Armcx3調控H9C2心肌細胞肥厚的作用研究*

蔡邦蘭，范 玥，稅新東，王建東，張 紅△

1.成都醫學院 檢驗醫學院 (成都 610500)；2.四川省動物源性食品獸藥殘留防控技術工程實驗室 (成都 610500)；3. 四川科倫博泰生物醫藥股份有限公司(成都 610072)；4. 成都醫學院 生物科學與技術學院 (成都 610500)

心肌肥厚是心臟為適應各種刺激而產生的心肌細胞體積增大，持續運動鍛煉常誘導生理性肥厚發生，這種心肌肥厚是可逆的；而當心臟處于慢性持續壓力狀態，如高血壓和瓣膜疾病時，則會發生病理性肥厚，最終導致心力衰竭，增加猝死的發生率[1-2]。引起心肌肥厚的生理病理因素很多，而線粒體作為心肌細胞的主要能量來源，以及維系細胞內穩態的重要細胞器，其在心肌肥厚的發生發展中的發揮了重要作用[3-4]。因此，深入研究線粒體功能障礙在心肌肥厚發生中的作用機制具有非常重要的意義。X連鎖犰狳重復蛋白3 (armadillo repeat containing X-linked 3, Armcx3)，又被命名為上皮癌中X染色體缺失的Arm蛋白3 (arm protein lost in epithelial cancers on chromosome X 3, Alex3)，是Alex家族中的成員[5-6]。Armcx3是一個線粒體的外膜蛋白，已有研究[6-8]表明，Armcx3蛋白在調節線粒體的聚集和運動中發揮了重要作用，但是其在心肌肥厚中的作用還不清楚。本研究采用慢病毒轉染H9C2細胞，通過觀察過表達Armcx3與干擾Armcx3表達對H9C2細胞形態以及心肌肥厚標志物心房利鈉肽(atrial natriuretic peptide, ANP)和腦鈉肽(brain natriuretic peptide, BNP) mRNA含量的影響，以期探討Armcx3在調控H9C2細胞肥厚中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

H9C2細胞株購于中科院上海細胞典藏庫，慢病毒HBIV-puro、HBIV-Armcx3、HBIV-puro(shRNA)、HBIV-Armcx3(shRNA)由上海漢恒生物科技有限公司構建。DMEM完全培養基購自HyClone公司，胎牛血清購自BI公司。嘌呤霉素、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG、Alexa Fluor?555熒光標記驢抗兔IgG、Alexa Fluor?488熒光標記山羊抗小鼠IgG購自碧云天生物科技研究所。細胞總RNA提取試劑盒購自成都福際生物技術有限公司，一步法RNA反轉錄試劑盒、SYBR GREEN實時熒光定量PCR預混液購自賽默飛世爾公司。兔抗Armcx3多克隆抗體購自愛博泰克生物科技有限公司，小鼠抗β-actin單克隆抗體購自成都正能生物技術有限責任公司，兔抗BNP多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，小鼠抗GAPDH單克隆抗體購自BioX公司。PVDF膜和ECL化學發光試劑購自Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 慢病毒感染H9C2細胞模型的建立 HBIV-puro、HBIV-Armcx3、HBIV-puro(shRNA)、HBIV-Armcx3(shRNA)等慢病毒采用梯度稀釋法測定并計算病毒滴度，經計算得到各組慢病毒滴度均達到2×108PFU/mL，可以用于下一步感染實驗。取對數生長期的H9C2細胞，接種于24孔板中，接種量5×104/孔，用含10%胎牛血清的DMEM培養基于37 ℃、5% CO2培養24 h，待細胞密度達70%～80%時，以病毒液與培養液體積比1∶9，分別加入HBIV-puro、HBIV-puro(shRNA)、HBIV-Armcx3、HBIV-Armcx3(shRNA)等慢病毒進行感染，24 h后，更換新鮮培養液并加入2.5 mg/L的嘌呤霉素篩選陽性細胞。持續篩選2周后，獲得各組慢病毒穩定感染H9C2細胞株。

1.2.2 蛋白質印跡技術(Western blot)檢測各組慢病毒穩定感染H9C2細胞中蛋白的表達 分別收集各組慢病毒穩定感染的H9C2細胞，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，于4 ℃，12 100 r/min，離心半徑6 cm，離心15 min，收集裂解上清液，BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳，每組上樣40 μg/泳道，PVDF膜濕轉60 min，分別加兔抗Armcx3抗體(1∶1 000)、兔抗BNP抗體(1∶1 000)、鼠抗GAPDH抗體(1∶5 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，分別加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1∶2 000)或山羊抗小鼠IgG(1∶2 000)，37 ℃孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL化學發光法檢測相關蛋白的表達。

1.2.3 免疫熒光技術觀察各組慢病毒穩定感染H9C2細胞形態及細胞表面積測定 分別收集各組慢病毒穩定感染的H9C2細胞，接種于放置了多聚賴氨酸包被圓玻片的24孔板中，接種量1.5×104個/孔，37 ℃、5% CO2培養24 h后，吸去培養基，PBS洗滌3次，冰甲醇-20 ℃固定15 min，PBS洗滌3次，使用含有羊血清和驢血清的封閉液室溫封閉1 h，加兔抗Armcx3抗體(1∶200)、小鼠抗β-actin抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3次，再加Alexa Fluor?555熒光標記驢抗兔IgG (1∶1 000)和Alexa Fluor?488熒光標記山羊抗小鼠IgG(1∶1 000)，室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，封片，利用熒光顯微鏡觀察照相。實驗重復3次，利用Image-Pro Plus軟件隨機統計各組慢病毒穩定感染的H9C2細胞中300個細胞的表面積。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測各組慢病毒穩定感染H9C2細胞中ANP和BNP的mRNA含量 分別收集各組慢病毒穩定感染的H9C2細胞，按照RNA提取試劑盒說明書提取各組H9C2細胞總RNA，采用紫外分光光度法檢測各組RNA的濃度，并按照反轉錄試劑盒操作說明合成cDNA，然后按如下程序進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time PCR，qPCR)：94 ℃，2.5 min；40個循環( 94 ℃，15 s；57 ℃，30 s；72 ℃，30 s)；72 ℃，10 min；添加熔解曲線。采用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對含量。qPCR引物由北京擎科新業生物技術有限公司合成，引物序列如下(表1)。

表1 qPCR擴增產物引物序列

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 Armcx3過表達與干擾Armcx3表達H9C2細胞模型的構建

分別收集各組慢病毒穩定感染的H9C2細胞，利用Western blot方法檢測各組H9C2細胞中Armcx3蛋白的表達情況。與對照組相比，過表達Armcx3慢病毒感染的H9C2細胞中，Armcx3蛋白表達明顯升高(P<0.001)；而與對照組相比，干擾Armcx3慢病毒感染的H9C2細胞中，Armcx3蛋白表達明顯降低(P=0.033)，表明Armcx3過表達與干擾Armcx3表達的H9C2細胞模型構建成功(圖1)。

2.2 Armcx3可以調控H9C2細胞肥厚

對各組慢病毒穩定感染的H9C2細胞進行細胞免疫熒光染色，結果所示，與對照組相比，過表達Armcx3的H9C2細胞形態明顯變得纖細，呈現收縮狀態；而干擾Armcx3表達的H9C2細胞，細胞形態明顯增大，呈攤餅狀(圖2)。

進一步利用Image-Pro Plus軟件隨機統計各組300個細胞的面積，結果所示，過表達Armcx3的H9C2細胞平均表面積約為(16 157±5 636)μm2，與對照組H9C2細胞平均表面積(21 465±7 265)μm2相比，其平均表面積明顯降低(P<0.001)；而干擾Armcx3表達的H9C2細胞平均表面積為(31 569±15 068)μm2，與對照組H9C2細胞平均表面積(21 425±7 307)μm2相比，其平均表面積明顯增加(P<0.001)(圖2)。

圖1 Western blot檢測各組H9C2細胞中Armcx3蛋白的表達

注：A：Western blot檢測各組H9C2細胞中Armcx3蛋白的表達；B：各組H9C2細胞中Armcx3蛋白含量的統計分析；1：HBIV-puro慢病毒感染的H9C2細胞；2：HBIV-Armcx3慢病毒感染的H9C2細胞；3：HBIV-puro(shRNA)慢病毒感染的H9C2細胞；4：HBIV-Armcx3(shRNA)慢病毒感染的H9C2細胞；與對照組比較，*P< 0.05，***P< 0.001

圖2 Armcx3過表達與干擾Armcx3表達對H9C2細胞形態的影響(×400)

注：A：免疫熒光檢測各組H9C2細胞中β-actin、Armcx3的表達和分布情況；B：各組H9C2細胞中細胞面積的統計分析；1：HBIV-puro慢病毒感染的H9C2細胞；2：HBIV-Armcx3慢病毒感染的H9C2細胞；3：HBIV-puro(shRNA)慢病毒感染的H9C2細胞；4：HBIV-Armcx3(shRNA)慢病毒感染的H9C2細胞；綠色：β-actin；紅色：Armcx3；藍色：DAPI；與對照組比較，***P< 0.001；每組統計細胞數n=300

2.3 Armcx3可以調控H9C2細胞中ANP和BNP的mRNA水平

利用實時熒光定量PCR檢測各組H9C2細胞中ANP和BNP的mRNA含量。與對照組相比，過表達Armcx3慢病毒感染的H9C2細胞，ANP和BNP的mRNA含量分別為(0.32±0.16)和(0.16±0.03)，均明顯降低(P=0.002，P=0.005)；而與對照組相比，干擾Armcx3慢病毒感染的H9C2細胞，ANP和BNP的mRNA含量分別為(2.08±0.34)和(2.90±0.53)，均明顯升高(P<0.001)(圖3)。

2.4 Armcx3調控H9C2細胞中BNP蛋白的表達

利用Western blot方法檢測各組H9C2細胞中BNP蛋白的表達情況。與對照組相比，過表達Armcx3慢病毒感染的H9C2細胞中，BNP蛋白表達明顯降低(P=0.038)；而干擾Armcx3慢病毒感染的H9C2細胞中，BNP蛋白表達明顯升高(P<0.001)。以上結果表明，過表達Armcx3抑制H9C2細胞肥厚，而干擾Armcx3表達則誘導H9C2細胞肥厚(圖4)。

圖3 qPCR檢測各組H9C2細胞中ANP和BNP的mRNA含量

注：A：qPCR檢測過表達Armcx3的 H9C2細胞中ANP的 mRNA含量；B：qPCR檢測干擾Armcx3表達的H9C2細胞中ANP的mRNA含量；C：qPCR檢測過表達Armcx3的H9C2細胞中BNP的mRNA含量；D：qPCR檢測干擾Armcx3表達的H9C2細胞中BNP的mRNA含量；1：HBIV-puro慢病毒感染的H9C2細胞；2：HBIV-Armcx3慢病毒感染的H9C2細胞；3：HBIV-puro(shRNA)慢病毒感染的H9C2細胞；4：HBIV-Armcx3(shRNA)慢病毒感染的H9C2細胞；與對照組比較，**P< 0.01，***P< 0.001

圖4 Western blot檢測各組H9C2細胞中BNP蛋白的表達

注：A：Western blot檢測各組H9C2細胞中BNP蛋白的表達；B：各組H9C2細胞中BNP蛋白含量的統計分析；1：HBIV-puro慢病毒感染的H9C2細胞；2：HBIV-Armcx3慢病毒感染的H9C2細胞；3：HBIV-puro(shRNA)慢病毒感染的H9C2細胞；4：HBIV-Armcx3(shRNA)慢病毒感染的H9C2細胞；與對照組比較，*P<0.05,***P<0.001

3 討論

心肌肥厚是由于壓力負荷和心臟容量增加而導致心肌細胞體積或面積增大的一種典型生理病理特征，此時心肌細胞內β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)、ANP、BNP等表達量明顯增多[9-10]。如果心肌肥厚由代償期發展為失代償期，可使心肌功能不足以維持正常功能，從而導致心力衰竭的發生。因此，探究心肌肥厚的發生發展機制對延緩心力衰竭的發生具有重要臨床意義[10-11]。

心臟是人體對能量需求最高的器官之一，而線粒體是心肌細胞內ATP最主要的來源。近年來研究[12-13]已證實，線粒體功能障礙和心肌肥厚的發生發展密切相關，線粒體在能量代謝、氧化應激、鈣穩態、基因突變等方面參與心肌肥厚的發生過程。值得注意的是，線粒體的動力學變化，如融合和分裂導致線粒體形態的變化，也參與了心臟應激和心肌細胞死亡的病理反應過程，已有研究[14]發現，線粒體融合蛋白1/2(mitofusin 1/2，Mfn1/2)、視神經萎縮蛋白(optic atrophy 1，OPA1)、動力相關蛋白1(dynamin-like protein 1，Drp1)和線粒體分裂蛋白1(mitochondrial fission 1，Fis1)等可能通過調控線粒體的融合和分裂進而參與心肌肥厚的發生過程。除此之外，線粒體在細胞內還存在運輸和停泊等胞內運動，但其是否參與心肌肥厚的發生過程，目前還不清楚。

Armcx3屬于Armcx基因家族成員，該家族成員只存在于進化程度較高的哺乳動物中，都由一個共同祖先Armc10基因進化而來。已有研究[15-16]發現,該家族蛋白在調節神經軸突線粒體的運輸、促進神經元存活和軸突再生中都發揮了重要作用。López-Doménech等[6]和Serrat等[7]發現，Armcx3能夠與線粒體外膜GTP酶蛋白Miro1、Miro2，以及Kinesin銜接蛋白Trak2等形成的KIF5/Miro/Trak2復合物相結合，干擾Armcx3表達，能夠明顯降低神經元軸突中運動線粒體的比率，表明Armcx3可能通過KIF5/Miro/Trak2復合物介導線粒體在神經元軸突中的運動。那么，Armcx3調節線粒體的運輸和胞內分布是否也參與心肌肥厚的發生過程？本研究采用慢病毒構建過表達Armcx3與干擾Armcx3表達的H9C2心肌細胞模型，研究Armcx3在H9C2細胞肥厚中的作用。研究結果顯示，與對照組相比，過表達Armcx3的H9C2心肌細胞的表面積明顯減小，細胞肥厚標志物ANP和BNP的mRNA含量明顯減少，BNP的蛋白表達量也明顯減少；相反，與對照組相比，干擾Armcx3表達的H9C2細胞表面積明顯增大，ANP和BNP的mRNA含量明顯增加，BNP的蛋白表達量也明顯增加。這一結果表明過表達Armcx3可以抑制H9C2細胞肥厚，而干擾Armcx3表達可以誘導H9C2細胞肥厚，但是Armcx3是怎樣通過調節線粒體的運輸和胞內分布進而調節細胞肥厚，其具體機制還有待進一步研究。

綜上所述，本研究初步證實Armcx3能夠調控H9C2細胞肥厚的發生過程，而進一步深入研究其分子機制將為心肌肥厚的機制研究和診治提供新的思路。