膜聯蛋白A1及其模擬肽Ac2-26對高糖誘導大鼠心肌細胞炎癥反應的影響

陳建康，嚴瑜，潘曉莉，周密，張文泉，楊潔，朱鵬立

（福建省立醫院老年科，福建醫科大學省立臨床醫學院，福建省臨床老年病研究所，福州 350001）

2型糖尿病病程長，易導致心、腦、腎、血管等器官發生并發癥。糖尿病心肌病變是主要并發癥之一，以心力衰竭為主要表現，嚴重可導致患者死亡。糖尿病心肌病變機制尚未明確，目前多認為與氧化應激、炎癥反應、細胞死亡、自噬等有關［1］。炎癥反應是糖尿病導致心肌病變的重要原因之一，已有研究［1-3］證實炎癥反應可以使氧化應激活性氧簇（reactive oxygen species，ROS） 增加，促進粒細胞、單核細胞等炎癥細胞的聚集和遷移，增加炎癥復合物形成，刺激炎性細胞因子［腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1β （interleukin-1β，IL-1β） 等］分泌，增加轉化生長因子-β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1） 表達，從而導致心肌細胞損傷，進一步造成心肌重塑，形成糖尿病心肌病變。目前，一些研究［2-6］表明通過抑制炎癥反應可改善糖尿病心肌病變。

已有研究［7-8］表明膜聯蛋白A1是重要的抗炎物質，它通過抑制磷脂酶A2 （phospholipase A2，PLA2）來減少炎癥反應復合物形成；抑制炎性細胞因子（TNF-α、IL-1β等） 分泌，改善炎癥反應。模擬肽Ac2-26是膜聯蛋白A1的小分子片段，由體外獲得，具有與膜聯蛋白A1相似生物學效應［9］。本課題組前期研究［10］發現膜聯蛋白A1改善糖尿病大鼠心功能可能與炎癥反應有關。本研究通過體外研究探討膜聯蛋白A1及模擬肽Ac2-26對高糖誘導的大鼠心肌細胞炎癥反應的影響。

1.1 材料與方法

1.1 實驗動物、儀器及試劑

出生3 d內的清潔級SD大鼠購于福建省醫學科學研究院動物中心［動物質量許可證號：SYXK （閩）2017-0011］，雌雄不限。主要儀器和試劑：TP800 型實時熒光定量 PCR 儀 （日本 TaKaRa公司）、超凈工作臺 （常州普天儀器制造有限公司）、CO2培養箱 （德國科峻公司）、流式細胞儀 （美國貝克曼庫爾特有限公司）、DMEM培養基 （美國 Gibco 公司）、總 RNA 抽提試劑盒 （上海飛捷生物技術有限公司）、逆轉錄試劑盒 （大連寶生物工程有限公司）；兔抗大鼠TNF-α、IL-1β （南京建成生物工程研究所），模擬肽Ac2-26 （美國Santa Cruz公司）。

1.2 方法

1.2.1 心肌細胞制備：取6只大鼠置于超凈工作臺上，取其心室肌組織，4 ℃D-Hanks液洗凈，用細組織剪刀剪碎心室肌組織，0.1%胰蛋白酶消化為單細胞懸液，細胞差速貼壁1.5 h后，用含100 mL/L胎牛血清DMEM 培養液使未貼壁心肌細胞稀釋成5×10-5/L，應用0.1 mmol/Brdu 抑制培養基中非心肌細胞增殖，然后將心肌細胞接種在 6 孔板中，每孔為2 mL，置于37 ℃細胞培養箱中繼續孵育48 h，換成無血清培養液對心肌細胞進行處理。

1.2.2 實驗分組及干預：根據預實驗結果，Ac2-26濃度以0.1 mg/mL作為標準劑量干預。將分離的大鼠原代心肌細胞培養 48 h后換液，在倒置顯微鏡下觀察心肌細胞長勢，待其細胞長至 90%融合時，將細胞隨機分組：正常對照組［葡萄糖 （5.5 mmol/L） DMEM培養基進行培養］、正常干預組［葡萄糖 （5.5 mmol/L）DMEM 培養基、Ac2-26 （0.1 mg/mL） 進行培養］、高糖模型組［葡萄糖 （30 mmol/L ） DMEM 培養基進行培養） ］、高糖治療組［葡萄糖 （30 mmol/L） DMEM 培養基、Ac2-26 （0.1 mg/mL） 進行培養］。各組細胞均繼續培養48 h后收集細胞。

1.2.3 TNF-α、IL-1β檢測：收集各組細胞上清液，按照試劑盒步驟采用ELISA法測定TNF-α、IL-1β水平。

1.2.4 實時 PCR檢測膜聯蛋白A1及PLA2 mRNA表達：原代心肌細胞培養結束后，各培養皿用PBS洗2遍，裂解細胞，提取總RNA及cDNA，按Trizol法提取總RNA，參照說明書對膜聯蛋白A1及PLA2進行逆轉錄和PCR擴增，膜聯蛋白A1正反引物序列分別為5'-TCGCAATGAAGGACGATAG-3'和5'-ATATCCTC TTACAGTC-3'，擴 增 長 度 分 別 為307 bp、318 bp，PLA2正反引物序列分別為5'-TCTGTCCAATGACGG AGTC-3'和5'-CTAGTCCAGATTTCTGCCCGTACG-3'，擴增長度分別為296 bp、301 bp，使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠拍照系統自動拍照，最后對圖像進行分析。

1.3 統計學分析

2 結果

結果顯示，與正常對照組比較，正常干預組膜聯蛋白A1、PLA2 mRNA 表達，TNF-α、IL-1β水平下降，但差異無統計學意義 （P ＞ 0.05）。與正常對照組比較，高糖模型組膜聯蛋白A1及PLA2 mRNA 表達，TNF-α、IL-1β水平顯著上升，差異有統計學意義 （P ＜0.01）。與高糖模型組比較，高糖治療組PLA2 mRNA表達，TNF-α、IL-1β水平明顯下降，差異有統計學意義 （P ＜ 0.01）；而膜聯蛋白A1 mRNA 表達下降，但差異無統計學意義 （P ＞ 0.05）。見圖1，表1、2。

3 討論

圖1 各組膜聯蛋白A1及PLA2 mRNA表達Fig.1 Expression of Annexin A1 and PLA2 mRNA in each group

研究［11］顯示，糖尿病可以誘發心力衰竭發作或者促進其發展，糖尿病心肌病是非缺血性心肌病的重要病因。既往研究［12］表明糖尿病病程進展中伴隨著炎癥反應，特別在形成并發癥時炎癥反應始終參與其中，糖尿病心肌病病變過程中伴隨著炎癥反應增強。因此通過抑制炎癥反應可以改善糖尿病心肌病［2］。

膜聯蛋白A1是膜聯蛋白超家族中的一員，依賴鈣離子與細胞膜磷脂結合，又稱為依鈣蛋白、磷脂酶A2抑制蛋白，大部分器官、組織均可以表達，在粒細胞/單核細胞中呈更高水平表達。膜聯蛋白A1是外周系統重要的抗炎物質，改善機體炎癥反應。既往對于膜聯蛋白A1研究多集中在感染、腫瘤等方面，近年有些研究［13-16］表明膜聯蛋白A1與心腦血管疾病 （動脈粥樣硬化、心肌再灌注損傷、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、腦梗死、機體臟器纖維化等） 也有密切關系。模擬肽Ac2-26是膜聯蛋白A1裂解的小分子片段，同樣具有強大的抗炎活性，可以改善心肌梗死、抑制小膠質細胞釋放炎癥介質［17-18］。 PLA2是炎癥復合物、炎癥介質合成釋放的關鍵酶，在炎癥反應過程中發揮重要作用；炎性細胞因子TNF-α、IL-1β主要由單核-巨噬細胞分泌，同樣在炎癥反應發揮重要作用。本研究采用高糖負荷心肌細胞，模擬糖尿病對心肌病變的影響。結果顯示，與正常對照組比較，正常干預組膜聯蛋白A1、 PLA2 mRNA表達，TNF-α、IL-1β水平沒有統計學差異 （均P ＞ 0.05），說明Ac2-26干預效果有限，同樣對膜聯蛋白A1影響不明顯；而在高糖模型組膜聯蛋白A1及PLA2 mRNA表 達，TNF-α、IL-1β水 平 都 明 顯 上 升 （均P ＜ 0.05），說明糖尿病病程中存在明顯炎癥反應，膜聯蛋白A1抗炎作用明顯增加。與高糖組比較，高糖治療組PLA2 mRNA表達，TNF-α、IL-1β水平明顯下降 （均P ＜0.05），提示Ac2-26改善了高糖誘導的心肌細胞的炎癥反應，但膜聯蛋白A1下降不明顯，進一步證實了Ac2-26對膜聯蛋白A1影響有限，同時膜聯蛋白A1維持較高水平繼續發揮抗炎作用。既往研究［14］表明膜聯蛋白A1及Ac2-26在體內、體外對缺血再灌注心肌損傷均具有改善作用，本研究證實膜聯蛋白A1與高糖誘導心肌細胞的炎癥反應關系密切，Ac2-26能夠明顯減輕炎癥反應。推測其機制可能是Ac2-26通過抑制PLA2表達使花生四烯酸、前列腺素、血小板活化因子等炎癥活性物質分泌減少，減輕炎癥反應，同時抑制PLA2表達后抑制了中性粒細胞表面整合素和脂多糖的表達，使TNF-α、IL-1β分泌減少；另外Ac2-26抑制單核細胞、巨噬細胞等趨化、聚集功能，下調炎性細胞因子TNF-α、IL-1β表達來改善炎癥反應。

表1 各組膜聯蛋白A1、PLA2 mRNA表達比較Tab.1 Comparison of Annexin A1 and PLA2 expression among the different groups

表2 各組TNF-α、IL-1β水平比較 （ng/L）Tab.2 Comparison of TNF-α and IL-1β level among the different groups （ng/L）

綜上所述，膜聯蛋白A1與高糖誘導心肌細胞炎癥反應明顯相關，模擬肽Ac2-26改善了高糖誘導的心肌細胞炎癥反應，推測在體內同樣可以改善糖尿病大鼠心肌病變，本研究為模擬肽Ac2-26治療糖尿病心肌病提供了實驗依據。