糖尿病腎病患者循環miRNA表達譜的分析

李露露，蒲實，范秋靈，汪旭，李卅立

（中國醫科大學附屬第一醫院腎內科，沈陽 110001）

糖尿病腎病 （diabetic nephropathy，DN） 是糖尿病嚴重的微血管并發癥之一，也是全世界范圍內終末期腎衰竭的主要病因［1］。2015年，我國糖尿病相關慢性腎臟病患者已超過腎小球腎炎相關慢性腎臟病患者，成為我國住院慢性腎臟病患者的主要原因［2］。目前DN的治療方法為藥物及替代療法，但都不能做到有效治療［3］。因此，尋找用于早期診斷和有效治療的新型生物標志物至關重要。

miRNA是一類非編碼內源性RNA （20～30個核苷酸），它通過與特定mRNA的3'非翻譯區 （3'UTR）結合來調控基因的表達，誘導其降解或翻譯抑制。已有研究［4］發現miRNA涉及許多基因表達的轉錄后調控，在凋亡、DNA修復、氧化應激反應、細胞發育等過程中發揮重要作用。在DN中，越來越多的研究［5］發現miRNA靶向炎癥、纖維化和氧化應激等相關基因，其表達變化不僅可以用于診斷DN，還可以預測與疾病相關的分子信號機制。本研究利用miRNA芯片檢測DN患者、糖尿病患者、健康對照者血清中miRNA的表達譜，通過實時PCR驗證結果，并對其功能及可能作用的靶點進行分析和預測，為進一步研究DN發生發展的分子機制及開發新的診斷和治療靶點提供理論基礎和依據。

1 材料與方法

1.1 一般資料及分組

選取2012年2月至2013年3月中國醫科大學附屬第一醫院腎內科行腎活檢，血肝酐＜200 μmol/L，病理確診為結節性糖尿病腎小球硬化癥患者為DN組 （n = 5）； 同期本院住院治療的2型糖尿病患者 （尿微量白蛋白＜30 mg/g） 為DM組 （n = 5）；2組患者均符合WHO糖尿病診斷標準 （空腹血糖≥7 mmol/L或口服75 g無水葡萄糖粉2 h后血糖≥11.1 mmol/L）。同期于本院健康體檢者為對照組 （n = 5），對照組空腹血糖、餐后2 h血糖、糖化血紅蛋白、血肝酐均在正常范圍內，尿微量白蛋白＜30 mg/g。排除標準：惡性腫瘤、心血管疾病、肝損傷等可能影響miRNA表達的慢性疾病。DN組、DM組和對照組年齡、性別、吸煙史、血壓、血管危險因素相匹配。

1.2 標本收集

采用非抗凝管收集空腹外周血 （5 mL），室溫下放置0.5～2 h凝固，使用CS-15R離心機 （德國BECKMAN公司）， 4 ℃， 1 700 g離心10 min，分組收集血清后再以2 000 g離心10 min完全去除細胞碎片。等分后-80 ℃儲存。

1.3 血清總RNA提取和純化

按照TRIzol LS Reagent （美國Invitrogen公司） 和mirvanaTMmiRNA isolation kit （美國Ambion公司） 使用說明書進行RNA提取和純化，nanodrop-2000檢測純化RNA濃度，凝膠電泳檢測RNA完整性。

1.4 miRNA芯片高通量篩選

將提取血清總RNA進行靶標制備，芯片雜交，芯片清洗染色與掃描后，應用miRNA芯片分析系統（Affymetrix? GeneChip? Command ConsoleTM1.1，miRNA QC Tool軟件） 篩選3組血清中表達有差異的miRNAs。篩選標準：（1） B通道，Ratio≥2為上調＞2倍的miRNA；（2） A通 道，Ratio≤0.5為 下 調＞2倍 的miRNA。參 照miRNA數據庫the Sanger miRBase miRNA database V11確認miRNA的序列，并應用Cluster 3.0 軟件進行聚類分析。

1.5 實時PCR檢測

按照miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒和miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒說明書進行反轉錄和擴增。

1.6 生物學信息分析

應用互聯網miRNA靶基因預測軟件Pictar、Targetscan、MiRanda在線服務站點搜索差異表達miRNA的預測靶基因，取至少2個軟件預測到的基因作為主要靶基因。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 芯片實驗檢測結果

2.1.1 DM組與對照組miRNA表達比較：結果顯示，與對照組比較，DM組患者血清中20個miRNA （miR-572、miR-603、miR-375等） 表達上調，其中miR-572上調最明顯 （4.22倍），見圖1；22個miRNA （miR-15b、miR-138、miR-875-5p等） 表達下調，其中miR-15b下調最明顯 （34.97倍），見圖2。

圖1 與對照組比較DM組血清中上調的miRNAs

圖2 與對照組比較DM組血清中下調的miRNAs

2.1.2 DN組與DM組miRNA表達比較：結果顯示，與DM組比較，DN患者血清中42個miRNA表達上調，包括miR-193a-5p、 miR-517c、 miR-155、 miR-638等，其中miR-193a-5p與miR-517c上調最明顯 （分別為8.07倍、7.95倍），見圖3；19個miRNA表達下調，包括miR-127-3p、miR-375、miR-572等，其中miR-127-3p下調最明顯 （28.49倍），見圖4。相反，DM組與對照組比較差異最顯著的是miR-572和miR-15b （miR-572反而下調4.61倍，miR-15b上調1.88倍）。而DM組與對照組比較，血清中miR-193a-5p下調2.09倍，miR-517c在對照組中未檢測出，miR-127-3p上調3.97倍。

圖3 與DM組比較DN組血清中上調的miRNAs

2.2 RT-PCR驗證結果

為了驗證miRNA芯片數據的可靠性，選擇部分差異性表達的miRNA進行熒光定量檢測，結果顯示，對照組、DM組和DN組中miR-1179呈遞增式上調，miR-148b、miR-150呈遞減式下調，見表1。

2.3 miR-1179、miR-148b和miR-150靶基因預測

miRNA靶基因預測軟件結果顯示，miR-148b調控763個預測靶基因 （BCL2、USP33、ZFYVE26、TGFB2、HSPA4L、PODXL、FGF2等） 的表達，廣泛參與信號轉導、足細胞損傷、wnt-β通路調控的上皮間充質轉分化等病理過程，見表2。miR-150調控287個預測靶基因 （ Notch信號通路、MAPK13、CBL、GLUT4等，參與細胞凋亡、信號轉導、葡萄糖轉運等的表達）。miR-1179調控337個預測靶基因 （TGFBR2、ZNF22、 MTPN、 FGF11、 CDH6、 SMAD等） 的表達，廣泛參與細胞凋亡、細胞外基質增生等病理過程。

圖4 與DM組比較DN組血清中下調的miRNAs

表1 3組miR-1179上調倍數和miR-148b、miR-150下調倍數比較Tab.1 Comparison of the fold downregulation of miR-148b and miR-150，and the fold upregulation of miR-1179 among the three groups

表2 miR-148b的預測靶基因Tab.2 Predicted target genes of miR-148b

3 討論

目前，對于DN診斷和疾病進展檢測依賴于尿微量白蛋白檢測。然而并非所有微量白蛋白尿患者都會出現明顯的蛋白尿和腎病。此外，檢測到微量蛋白尿時組織損傷和炎癥可能已經發生，微量蛋白尿對DN無特異性，僅是腎小球損傷的一個標志。腎活檢目前是診斷DN的主要方式，但是這種侵入性且昂貴的手術仍有3%發生嚴重并發癥的風險［6］。因此，發現診斷和判斷DN預后的新型生物標志物具有重要意義。

miRNA是一類能夠調控mRNA表達的小分子非編碼RNA。據報道，在人類已鑒定出2 500余種成熟miRNA，調節至少60%的蛋白質編碼基因［7］。因此，miRNA可以調節許多基因表達，以改變關鍵的細胞功能來影響各種疾病的進展。由于miRNA在生物流體 （尿液和血漿） 中穩定表達，同時隨著高通量測序、定量PCR、微陣列技術的建立，作為DN敏感、非侵入性和階段特異性精確診斷的生物標志物，miRNA研究已經變得非常有意義［5］。許多miRNA與DN的發生或微量白蛋白尿的出現相關，并直接靶向腎臟纖維化途徑，包括轉化生長因子-β和抑癌基因PTEN，進而導致糖尿病腎臟病理損傷［8］。另一方面，由于疾病進展的癥狀和分子機制可能因患者而異，未來患者可能會根據其個體miRNA特征分離出個性化藥物和治療。課題組先前研究［9］發現，miR-503和miR-181d在糖尿病KKAy小鼠腎小球內的表達顯著上調，氯沙坦治療可抑制其在糖尿病狀態下的異常表達，可能為DN提供新的有效治療方法。

本研究發現3組血清中存在249個差異性表達的miRNA；其中miR-1179呈遞增式上調，miR-148b、miR-150呈遞減式下調。miR-1179調控337個預測靶基因的表達，包括TGFBR2、ZNF22、MTPN、FGF11、CDH6、SMAD等，廣泛參與細胞凋亡、細胞外基質增生等病理過程的發生。近期研究［10-12］發現miR-1179靶向細胞周期蛋白 （cyclin E1，CCNE1） 與非小細胞肺癌 （non-small cell lung cancer，NSCLC） 的細胞增殖相關，miR-1179靶向E2F轉錄因子5 （E2F5） 控制細胞周期轉變，miR-1179過表達可通過E2F5抑制膠質母細胞瘤細胞的增殖能力并誘導細胞周期停滯，此外，在胰腺癌細胞miR-1179的過表達抑制細胞遷移和侵襲，而其在DN中的作用尚未見報道。

miR-148b調控763個預測靶基因的表達，包括TGFB2、BCL2、USP33、ZFYVE26、TGFB2等，廣 泛 參與信號轉導、足細胞損傷、wnt-β通路調控的上皮間充質轉分化等病理過程的發生。研究［13］發現miR-148靶向TGF-β通路調節皮膚傷口愈合過程中的血管生成和內皮-間質轉化。因此猜測miR-148的下調可能促進TGF-β信號增強，與DN纖維化的發生密切相關。目前已有不少研究［14］報道miR-148b在不同疾病中的作用機制 （miR-148/miR-152家族成員是自身免疫性疾病、慢性炎癥性疾病和多種癌癥的預后標志物和潛在治療靶點）。SERINO等［15］在腎臟疾病中發現血清miR-148b和let-7b對于診斷IgA腎病具有特異性，可能是一個新型、可靠、非侵入性的診斷方法；此外，KUWAGATA等［16］發現在糖尿病狀態下，缺氧近端腎小管上皮細胞 （proximal tubular cell，PTC） 中mTORC1活化，其通過減少miR-148b-3p表達使TNFR2過表達而導致細胞凋亡，調節致病途徑可能成為糖尿病PTC損傷的新療法。miR-148可能在DN的發生發展中發揮重要作用，其可能的作用機制有待進一步深入研究。

miR-150調控287個預測靶基因的表達，包括Notch信號通路、MAPK13、CBL、GLUT4等，參與細胞凋亡、信號轉導、葡萄糖轉運等。近年來，許多臨床研究發現miR-150具有潛在的預后價值。在慢性淋巴性白血病中，miR-150顯著下調，與疾病的發生相關［17］。在各種其他實體腫瘤組織 （肺癌、乳腺癌、食道癌、結腸直腸癌和胰腺癌） 中也發現了miR-150的異常表達。miR-150已被證實在食管鱗狀細胞癌和原發性結直腸癌中顯著下調，預示著預后不良。在乳腺癌細胞系中，miR-150表達增加，促進生長和克隆形成，并減少細胞凋亡。另外的研究表明miR-150在其他腫瘤 （前列腺癌和甲狀腺癌） 中表達增加。miR-150有可能成為監測癌癥預后和進展的新的預測因子［18］。在狼瘡性腎炎中，miR-150通過下調SOCS1促進腎臟纖維化，是狼瘡性腎炎腎損傷的生物標志物［19］。YANG等［20］發現miR-150可能在DN間充質干細胞的治療中發揮重要作用。此外，XIE等［21］通過比較有和沒有大量白蛋白尿的2型糖尿病患者尿外泌體中差異性表達的miRNA，發現miR-150-5p上調，可能是早期DN患者的新型生物標志物。

綜上所述，本研究結果豐富了DN miRNA差異表達譜，這些差異性表達的miRNA可能涉及DN的發生和發展，但需進一步對篩選出的差異miRNA進行多中心、大樣本的臨床驗證和功能學研究，進而將研究成果向臨床應用轉化，找到DN的新型生物標志物和治療新靶點。