急性髓系白血病SPRED1基因啟動子甲基化狀態的研究

孫精文，張蕊，李艷

（中國醫科大學附屬第一醫院血液科，沈陽 110001）

急性髓系白血病 （acute myeloid leukemia，AML）是一組以造血干細胞增殖失控，分化受阻，同時抑制正常造血為特點的異質性造血系統惡性疾病。近年來，隨著基因組研究的不斷深入，發現表觀遺傳學的修飾作用，如DNA甲基化狀態的改變，特別是抑癌基因啟動子的甲基化，引起抑癌基因沉默，是影響白血病發生和發展的重要分子機制［1］。表觀遺傳修飾是指不涉及DNA序列改變的一種可逆的、動態的及可隨細胞分裂而遺傳的基因調節方法［2］。DNA甲基化是目前表觀遺傳學最主要及常見的基因轉錄前調控機制［3-4］，出現在不同的疾病中，如膠質母細胞瘤［5］、淋巴細胞白血病［6］和AML［7］。已有文獻［8］中，大約50%的AML患者缺乏細胞遺傳學異常，處于中度風險組，而很大比例的患者攜帶未知AML相關調控基因［9-10］。因此，關于AML的發生和發展機制，表觀遺傳學修飾機制比只用體內突變來解釋更合理。

Ras/MAPK信號通路已被證實參與AML的發病機 制， SPRED1 （human sprout-related EVH1 domaincontaining 1） 是 參 與 調 控AML Ras/MAPK信 號 通路的抑癌基因［11-12］。SPRED1于2001年由YOSHIMURA等［13］在鼠的破骨細胞cDNA文庫中發現。SPRED1位于染色體15q13.2，編碼含有444個氨基酸的蛋白質，具有3個功能域，即N端的EVH1域、中間的c-kit結合域和C端的SPRY相關域，與SPRED2、SPRED3同屬于SPRED家族［14］。人類SPRED1在肺、腦、脊髓、腎臟和乳腺中高表達，在肝、胰腺、前列腺、甲狀腺、肌肉、骨骼、骨髓中表達相對較低［15-17］。SPRED1與神經纖維蛋白1 （protein-neurofibromin，NF1） 相互作用，下調Ras/MAPK信號通路［14］。在肝細胞癌、前列腺癌和淋巴瘤中，SPRED1可抑制Ras/MAPK信號通路和惡性細胞轉移。另外，SPRED1已被證實在兒童急性白血病中下調，是Ras/MAPK信號通路的抑癌基因［12］。然而SPRED1的下調機制目前仍未知。研究［18］發現，伴有SPRED1突變者具有白血病傾向，但后續研究［12，19］表明，SPRED1突變和缺失在AML并不常見。本研究擬探討AML患者SPRED1的表觀遺傳學狀態，分析其與SPRED1 mRNA水平和預后參數的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象：選擇2015年10月至2017年6月于中國醫科大學附屬第一醫院住院的AML患者共50例 （病例組） ，其中，男27例，女23例，年齡16～80歲 （中位年齡45歲）。所有患者依據2016年世界衛生組織AML分型標準［20］進行診斷、分型。對照組為20例健康志愿者，年齡18～75歲 （中位年齡54歲）。本研究獲得中國醫科大學倫理委員會批準 （#AFSOP-07-1.0-01） 以及研究對象和家屬的知情同意。

1.1.2 主要試劑：AxyPrep血基因組DNA小量試劑盒［康寧生命科學 （吳江） 有限公司］； M-MLV 逆轉錄酶試劑盒 （美國Promega公司）；Trizol試劑盒、SYBR GREEN試劑盒、單鏈cDNA合成試劑盒 （日本TaKaRa公司）；EZ DNA Methylation-Gold Kit、熱啟動的DNA聚合酶 （美國Zymo公司）。

1.1.3 主要儀器：NanoDropTM 2000分光光度計 （美國Thermo公司）；PCR儀 （7500，美國ABI公司）；K960熱循環儀 （杭州晶格科學儀器有限公司）；低溫高速離心機 （德國Eppendorf公司）；MassARRAY平臺 （美國Sequenom公司）。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取及實時熒光定量PCR：抽取骨髓樣本，用Trizol試劑盒從骨髓樣本的單個核細胞中提取RNA，紫外分光光度儀檢測A260/A280均為1.8～2.0，以確定其濃度與純度。用單鏈cDNA合成試劑盒逆轉錄合成cDNA，置于-20 ℃保存備用。行實時定量PCR，β-actin為內參照基因。PCR引物由Invitrogen公司合成，SPRED1正義引物序列為5'-GATGAGCG AGAGACGGAGAC-3'，反義引物序列為5'-GTCTCT GAGTCTCTCCACGGA-3'；β-actin正 義 引 物 序 列為5'-GTGGACATCCGCAAAGAC-3'，反義引物序列為5'-AAAGGGTGTAACGCAACTAA-3'。反應條件為95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環；95 ℃15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。隨后進行熔解曲線的獲取和分析，以確定PCR反應的特異性。SPRED1的相對表達量用2-ΔΔCt法計算。

1.2.2 DNA的提取及甲基化定量PCR：用AxyPrep血基因組DNA小量試劑盒從骨髓樣本的單個核細胞中提取DNA，紫外分光光度儀檢測A260/A280均為1.8～2.0。所有DNA立即硫化修飾處理或-20 ℃保存備用。參照EZ DNA Methylation Kit說明書，對抽提的DNA進行亞硫酸氫鹽處理，在MassARRAY平臺進行DNA甲基化的定量檢測。應用Sequenom EpiDesigner software （www.epidesigner.com） 設計引物，正義引物序列為5'-AGGATAATGTTGTTGTTGAGGTAGGagga agagag-3'，反義引物序列為5'-CTAAATCCCAAATA CTCCCAAATTCcagtaatacgactcactatagggagaaggct-3'。反應條件為94 ℃ 4 min；94 ℃ 20 s，64 ℃ 30 s，72 ℃1 min，40個循環；72 ℃ 5 min。

1.3 統計學分析

采用 SPSS 22.0軟件和GraphPad Prism軟件 （version 5.0，美國GraphPad Software公司） 進行統計分析及數據繪圖。采用Mann-Whitney檢驗評估病例組與對照組之間的SPRED1基因啟動子甲基化差異，采用Spearman相關系數r評估SPRED1基因啟動子甲基化狀態與mRNA水平和預后參數之間的相關性。所有檢驗均設定為雙側檢驗，P ＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AML患者SPRED1基因啟動子甲基化水平顯著升高

SPRED1基因 （#1：310-723 bp） 包含12個CpG位點 （圖1A），用Sequenom MassARRAY平臺分析50例AML患者和20例健康對照的甲基化水平。分析之前，進行嚴格的質量控制，刪除潛在的不可靠的測量數據［21］，包括少于30%的樣本檢測到的CpG位點（unreliable CpG units） 和丟失數據超過30%的樣本（unreliable samples），最后所獲得的有效CpG位點為9個。

#1_CpG_1在AML患者中的甲基化水平 （86.94%±8.61%） 明顯高于健康對照組 （82.70%±2.85%，P ＜0.01）；#1_CpG_2在AML患者中的甲基化水平 （86.18%±29.40%） 明顯高于健康對照組 （80.90%±28.98%，P = 0.031）；#1_CpG_11在AML患者中的甲基化水平（88.68%±15.38%） 高于健康對照組 （86.00%±7.71%，P = 0.039，圖1B），其他位點在AML病例組和健康對照組中均無統計學差異 （P ＞ 0.05）。

圖1 AML患者與健康對照組SPRED1啟動子甲基化水平的比較Fig.1 Comparison of SPRED1 gene promoter methylation levels between control individuals and patients with AML

2.2 AML患者SPRED1基因啟動子甲基化水平與SPRED1 mRNA表達水平呈負相關

AML患者的SPRED1 mRNA水平 （0.92±2.73） 明顯低于健康對照組 （1.77±4.79，P ＜ 0.01）。在AML患者中，#1_CpG_11甲基化水平與SPRED1 mRNA表達水平呈負相關 （r = -0.427，P = 0.004） （圖2A）；#1_CpG_2、#1_CpG_1甲基化水平與SPRED1 mRNA表達水平無統計學相關性 （r = -0.033，P = 0.822；r = -0.005，P =0.972） （圖2B、2C）。

2.3 SPRED1基因啟動子甲基化水平與AML患者的預后參數缺乏相關性

圖2 AML患者SPRED1基因啟動子甲基化水平與SPRED1 mRNA水平的相關性Fig.2 Correlation between SPRED1 gene promoter methylation level and SPRED1 mRNA expression level in AML patients

分析SPRED1#1_CpG_11甲基化水平與一系列AML患者預后相關的臨床和實驗室檢查參數之間的關系，包括年齡、性別、French-American-British（FAB） 分型、白細胞（white blood cell，WBC）數、血紅蛋白 （hemoglobin，Hb） 含量、血小板 （platelet，PLT）數、骨髓原始細胞數、染色體核型和基因突變，發現#1_CpG_11甲基化水平與上述預后參數之間均無相關性 （P ＞ 0.05）。依據2017年第3版AML美國國立綜合癌癥網絡 （national comprehensive cancer network，NCCN） 指南，基于細胞遺傳學和分子學異常，AML風險分層為低危、中危和高危3組，本研究結果表明低危組、中危組和高危組之間的SPRED1基因啟動子甲基化水平無統計學差異 （P ＞ 0.05），見表1。

根據在白血病發生發展中的作用，突變基因分為FLT3和c-KIT （促進增殖），CEBPA （減少分化），NPM1 （參與細胞周期調控） 以及DNMT3A、TET2和IDH1/2 （調控表觀遺傳學） 4類。50例AML患者中，46例發生了基因突變，其中，FLT3-ITD突變15例，c-KIT突變8例，CEBPA突變8例，NPM1突變9例，DNMT3A突變9例，TET2突變24例，IDH1/2突變17例。本研究顯示，#1_CpG_11甲基化水平與上述預后相關突變基因之間均無相關性 （P ＞ 0.05）。

3 討論

表觀遺傳學調控機制在疾病的發生發展中起重要作用，主要包括染色體重塑、組蛋白修飾、DNA甲基化、非編碼RNA調控等。DNA甲基化在真核細胞中是重要的表觀遺傳學調控機制，已被廣泛研究［22］。Sequenom MassARRAY 平臺具有高度的準確性、敏感性和高通量，是近幾年新興的基因甲基化定量檢測方法。MassARRAY系統相比亞硫酸鹽測序PCR （bisulfite sequencing PCR，BSP） 能更真實地反映低甲基化區域的甲基化水平，最低可以檢測到5%［23］，因此也更能準確地反映與基因表達水平之間的關系。本研究結果顯示，AML患者SPRED1基因啟動子甲基化水平增高，且與SPRED1 mRNA水平呈負相關，表明SPRED1基因啟動子甲基化狀態的改變可能影響其表達并促進白血病的發生與發展。本研究證實了抑癌基因SPRED1啟動子甲基化水平在AML患者中明顯增高，同時SPRED1基因表觀沉默。真核生物啟動子區域包括2部分，一是核心啟動子區，具備結合、控制轉錄起始前復合物的裝配、定位轉錄起始點、控制轉錄方向和響應胞內激活子或抑制子等功能，二是上游序列區，決定基因轉錄的特異性、活性和效率，確保精準轉錄。啟動子區元件構成及其功能對于轉錄水平的調控至關重要，因此筆者推測這可能是SPRED1基因不同位點甲基化水平與基因表達的相關性存在差異的原因，有待進一步研究。有研究［24］發現，SPRED1基因的表達水平與腫瘤浸潤和轉移的發生率呈負相關。體內外研究［25-26］也發現，SPRED1基因高表達可通過抑制制細胞外調節蛋白激酶 （extracellular regulated protein kinases，ERK） 的激活有效抑制腫瘤細胞。在兒童AML中已證實SPRED1基因表達的下調與Ras/MAPK通路的激活有關［12］。因此，推測SPRED1基因啟動子高甲基化狀態引起基因表達水平降低，促進Ras/MAPK通路激活，從而導致白血病的發生。

AML的發生發展與甲基化調控基因，如DNMT3A、TET2及IDH1/2的突變密切相關。DNMT3A是AML細胞DNA甲基化的重要介質，與不良預后密切相關［9，27］。IDH1/2和TET2突變與導致基因組高甲基化相關［27-28］。有研究［12］發現，FLT3突變與SPRED1基因低表達密切相關。CEBPA基因編碼一種造血干細胞分化相關的轉錄因子［29］，其突變與AML患者的良好預后密切相關［19］。在本研究中，未發現SPRED1基因啟動子甲基化狀態與突變基因之間的關系具有統計學意義，考慮可能是由于樣本量不足所致。未來還需研究SPRED1甲基化狀態與治療反應和預后的關系，全面了解SPRED1高甲基化狀態在AML發生發展中的作用。

表1 AML患者的臨床特征和SPRED1基因啟動子甲基化水平Tab.1 Clinical characteristics and SPRED1 gene promoter methylation in patients with AML