葛根素對創傷性腦損傷大鼠抗凋亡影響的機制分析

趙萬里 詹世欽 陳江生 馬文斌 李旭 覃波

518105廣東省深圳市寶安區松崗人民醫院，廣東深圳

創傷性腦損傷包括原發腦損傷與繼發性腦損傷，是造成45歲以下成年人群死亡的主要原因之一，目前臨床中并無有效治療藥物，給患者家庭和社會造成了沉重負擔[1]。已有研究指出[2]，氧化應激反應是造成繼發性腦損傷的主要病理機制，氧自由基損傷是影響創傷性腦損傷預后的重要影響因素之一。葛根素為天然多酚類化合物，結構與雌二醇相似，具有部分雌激素樣作用，作為天然抗氧化劑，可抑制脂質過氧化，清除各種氧自由基，保護細胞膜結構，具有降血壓、抗氧化、抗癌等多種藥理活性。在多種疾病模型中，葛根素能夠有效清除氧自由基，發揮抗氧化作用，有研究指出，其對老年性癡呆、缺血性腦卒中、缺血再灌注損傷等中樞神經系統疾病具有神經保護作用，但在創傷性腦損傷大鼠研究中的應用研究較少[3-4]。本研究對葛根素、對創傷性腦損傷大鼠抗凋亡影響的機制進行了分析，以期能為后期臨床研究深入和臨床治療提供指導和參考。

資料與方法

選擇健康成年雄性SD大鼠60只，體重250～300 g，構建TBI模型；隨機分為TBI組、假手術組和TBI給藥組(葛根素治療)，每組各20只。

方法：①TBI組：采用顱腦損傷撞擊器(型號：Benchmark TM)制作TBI模型，大鼠禁食12 h后在其腹腔內注入50 mg/kg 2%戊巴比妥麻醉，麻醉后將其俯臥固定于支架處，剝離骨膜將右頂骨暴露出來。于矢狀縫中線旁開2.5 mm，在冠狀縫和人字縫之間鉆5 mm直徑骨孔，使硬腦膜暴露出來。將電磁顱腦損傷撞擊器的傳動裝置安裝在腦立體定位儀上，使撞擊頭末端與硬腦膜垂直。設置撞擊器，以3 m/s速度用5 mm直徑的撞擊頭制作中度TBI，打擊時間為120 ms，打擊深度為2 mm。制作模型后立即移除撞擊器并縫合頭皮切口。大鼠恢復自主呼吸后重新進入飼養籠，進行損傷后觀察。②假手術組：步驟同上，但無沖擊損傷過程。③給藥組：制作模型15 min后，腹腔內注射60 mg/kg葛根素。

觀察指標：通過采用改良神經功能缺損評分(mNSS)評價神經功能，腦組織干濕重稱量法評價腦水腫，TUNEL染色評價腦損傷體積和神經元的凋亡，用酶活試劑盒檢測損傷48 h后抗氧化酶超氧化物歧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的活性以及氧化應激產物丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)和一氧化氮(NO)的水平，最后使用Westernblot法檢測Bax、Bcl-2及Bax/Bcl-2的表達水平。①mNSS評分：量表包括自發運動、運動對稱性、提尾時雙前肢對稱性、攀爬能力、觸須反應、驚嚇反應，依據大鼠行為能力對每個測試項目給予0～3分評分，總分為3～18分。②制備腦組織冰凍切片：向麻醉后小鼠左心室灌注大量冰生理鹽水，肝臟發白后再灌注少量濃度為4%聚甲醛，小鼠全身肌肉僵直后將其頭顱離斷并取出腦組織，浸泡并脫水處理，轉入CT膠包內行包埋預處理后置于恒溫箱處理切片，置于-80℃冰箱內備用。③TUNEL染色：依據試劑盒標準步驟行TUNEL染色，400倍顯微鏡下拍照并觀察，細胞核染上棕黃色顆粒為TUNEL陽性細胞，計算凋亡細胞數目。④抗氧化酶活性以及氧化應激產物測定：取出大鼠腦組織，測量GSSG、SOD、GSH、CAT、NO、MDA水平。⑤Westernblot法：取損傷邊緣區域的腦組織，提取總蛋白，Bradford法測定蛋白水平，分離樣品，電泳，常規轉膜，封閉；5%BSA稀釋一抗(兔抗Nrf-2單克隆抗體)，4℃孵育過夜；第2天用TBST進行洗膜，將膜浸入二抗稀釋液(1：10 000)中，室溫孵育2 h；TBST進行洗膜后加入ECL發光試劑，暗室進行曝光，顯色，Image J軟件用于數據分析。

統計學方法：數據采用SPSS23.0軟件分析；計量資料以(±s)表示，采用t檢驗；(P＜0.05)為差異有統計學意義。

表1 各組大鼠腦組織MDA、CAT、SOD和GSH含量比較(±s)

表1 各組大鼠腦組織MDA、CAT、SOD和GSH含量比較(±s)

組別 n GSSG NOμmol/(g·pro) SOD(U/mg) GSH(U/mg) MDA(nmol/mg) CAT(U/mg)TBI組 20 1.02±0.21 3.76±0.33 4.67±1.13 15.34±1.52 39.78±2.67 49.24±5.55假手術組 20 1.45±0.09 1.05±0.09 16.12±0.98 33.57±1.20 17.29±2.10 165.33±5.44 TBI給藥組 20 2.67±0.28 1.65±0.13 9.40±0.81 24.97±1.65 23.25±1.90 116.44±5.97 F 2.495 2.767 1.996 2.517 2.389 2.279 P 0.023 0.008 0.047 0.019 0.032 0.037

結 果

各組大鼠腦組織MDA、CAT、SOD和GSH含量比較：TBI給藥組大鼠腦組織GSSG、SOD、GSH、CAT水平均高于TBI組，NO、MDA水平均低于TBI組，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

各組大鼠TBI神經細胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達比較：TBI給藥組大鼠腦組織Bcl-2水平高于TBI組，Bax/Bcl-2及凋亡細胞數低于TBI組，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

腦水腫與mNSS評分比較：TBI給藥組大鼠腦組織塊重于TBI組，mNSS評分低于TBI組，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表3。

討 論

腦損傷后神經元細胞在多種因素作用下會發生凋亡，具體機制十分復雜，但已有大量動物實驗和臨床研究指出，TBI后PI3K/AKT通路與細胞凋亡密切相關，且與細胞生存有相關性[5]。因此臨床中可通過激活PI3K/AKT通路，調節腦缺血后氧化應激反應，抑制細胞凋亡和炎癥反應。目前臨床中已有研究指出，葛根素可有效緩解創傷性腦損傷所造成的氧化應激損傷，但尚未明確其具體機制，部分學者認為TBI所引起的神經功能方面的障礙與細胞破損、神經細胞凋亡存在相關性，因此我們猜測葛根素可影響PI3K/AKT通路，進而發揮抗氧化應激和抗細胞凋亡的作用[6-7]。本研究就葛根素對創傷性腦損傷大鼠抗凋亡影響的機制進行了探究。

目前臨床中葛根素主要應用于對缺血性腦卒中、老年性癡呆、再灌注損傷等疾病的治療，鮮有對于創傷性腦損傷的研究。曹建忠等人在就葛根素對全腦缺血再灌注損傷的神經保護作用進行探究[8]，結果顯示葛根素治療組再灌注后各個時間點的Bcl-2蛋白表達增加，Bax蛋白表達降低。由于葛根素為植物雌激素，主要成分為異黃酮，Lepar等人在研究中指出食物中植物雌激素分子可經血腦屏障進入大腦[9]，異黃酮對小腦及額葉皮層區內富含的ER-β具有較高的親和力，與其結合后發揮雌激素作用。葛根素可調節Bcl-2家族相關蛋白表達，增強Bcl-2蛋白免疫強度，進而緩解缺血缺氧性腦損傷，并發揮抗氧化作用，清除自由基，擴張腦血管，增加腦血流量，進而抑制神經細胞凋亡[10]。有研究指出，葛根素可顯著降低eNOS蛋白和基因的表達，緩解氧化應激損傷和心肌缺血性損傷，這一作用是通過PI3K/AKT信號通路介導，且其能夠通過cGMP和cAMP信號通路減輕鈣離子內流，發揮抗血管收縮作用，抑制神經細胞凋亡[11]。

表2 各組大鼠TBI神經細胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達比較(±s)

表2 各組大鼠TBI神經細胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達比較(±s)

組別 n Bcl-2 Bax Bax/Bcl-2 凋亡細胞數TBI組 20 9.80±1.64 10.24±2.05 1.07±0.31 13.64±2.55假手術組 20 3.94±1.33 5.90±1.02 1.63±0.65 1.90±0.43 TBI給藥組 20 11.74±2.11 10.18±3.12 0.84±0.17 10.68±2.46 F 2.456 1.827 2.524 3.098 P 0.028 0.076 0.018 0.002

表3 腦水腫與mNSS評分比較(±s)

表3 腦水腫與mNSS評分比較(±s)

組別 n 腦組織塊(g) mNSS評分(分)TBI組 20 0.068±0.05 15.44±3.25假手術組 20 0.171±0.08 7.68±2.13 TBI給藥組 20 0.124±0.09 9.22±3.06 F 2.352 2.858 P 0.034 0.004

綜上所述，葛根素可通過抑制氧化應激反應、減輕腦水腫、調節Bax/Bcl-2表達而發揮神經保護作用，進而抑制神經細胞凋亡。