PCSK9對(duì)急性胰腺炎局部并發(fā)癥及不良預(yù)后事件的預(yù)測價(jià)值

李正良， 蔡 瑜， 張順財(cái)

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院消化科，上海 200032

急性胰腺炎是由于多種病因?qū)е乱让冈谝认賰?nèi)被激活，引起胰腺自身消化的疾病；輕者為胰腺水腫，重者出現(xiàn)胰腺出血甚至壞死；急性胰腺炎起病急驟，會(huì)引起全身炎癥反應(yīng)綜合征，若出現(xiàn)局部和全身并發(fā)癥，則導(dǎo)致預(yù)后不良[1]。近年來，胰腺炎發(fā)病率呈逐漸升高的趨勢[2-3]；針對(duì)急性胰腺炎，目前臨床使用多種評(píng)分體系，如Ranson和APACHE Ⅱ評(píng)分系統(tǒng)；但在實(shí)際應(yīng)用中，這些量表均存在缺陷[4]。因此，有必要針對(duì)胰腺炎的早期診斷、患者分層以及新疾病預(yù)后指標(biāo)進(jìn)行進(jìn)一步研究。

無論何種病因引起的急性胰腺炎，均存在內(nèi)毒素血癥[5-6]。一是膽道中細(xì)菌毒素逆行入血；二是急性胰腺炎所致有效血容量不足和內(nèi)臟器官灌注不良，出現(xiàn)腸道上皮灌注不足，導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞缺血缺氧，腸道屏障功能減弱，腸壁通透性增加，腸道細(xì)菌入血；伴隨著腸蠕動(dòng)動(dòng)力減弱/消失，腹腔組織間隙滲出增加可能導(dǎo)致腹腔內(nèi)高壓，進(jìn)一步造成腸道菌群轉(zhuǎn)位及內(nèi)毒素血癥的發(fā)生。內(nèi)毒素可與免疫細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體結(jié)合，釋放大量炎癥因子，加劇全身炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致急性胰腺炎局部并發(fā)癥和預(yù)后不良[7-8]。

前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶Kexin 9型(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9, PCSK9)主要由肝細(xì)胞產(chǎn)生，既往認(rèn)為主要調(diào)節(jié)脂代謝。PCSK9通過與低密度脂蛋白受體(low-density lipoprotein receptor, LDLR)結(jié)合，促進(jìn)LDLR內(nèi)吞和溶酶體途徑降解，引起高脂血癥[9]。但最近的研究[10]發(fā)現(xiàn)，PCSK9除了血脂水平的調(diào)控外，細(xì)菌、病毒或寄生蟲感染均可誘導(dǎo)其表達(dá)，促炎癥因子(LPS、TNF-α、ox-LDL)亦可促進(jìn)PCSK9的合成和分泌。Walley等[14]報(bào)道了PCSK9在炎癥反應(yīng)中可能的作用；Dwivedi等[12]認(rèn)為PCSK9可作為LPS誘發(fā)腹膜炎大鼠模型的炎癥標(biāo)志，且使用PCSK9抗體處理可提高大鼠的生存率，為腹膜炎大鼠提供了保護(hù)作用。既往研究[13]也表明姜黃素可通過抑制PCSK9表達(dá)，改善大鼠肝硬化所致腸源性內(nèi)毒素血癥。但是，將PCSK9作為治療靶點(diǎn)能否在膿毒血癥中提供保護(hù)作用仍存在爭議[14-15]。

鑒于急性胰腺炎中存在腸道菌群轉(zhuǎn)位及內(nèi)毒素血癥的現(xiàn)象[16]，以及LPS可促進(jìn)PCSK9合成的特點(diǎn)，本研究擬檢測急性胰腺炎患者血清中PCSK9的濃度，隨訪PCSK9變化，并對(duì)PCSK9與患者疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性進(jìn)行研究，以期明確PCSK9作為急性胰腺炎局部并發(fā)癥的預(yù)測價(jià)值以及PCSK9作為AP預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)之一的可行性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年5月至2018年8月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院收治的急性胰腺炎患者46例，其中男性26例，女性20例，年齡29～88歲，平均(59±16.26)歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：符合急性胰腺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)；患者20～90歲；既往無胰腺炎病史，本次為初發(fā)初診胰腺炎。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴發(fā)肝臟占位或其他惡性腫瘤個(gè)人史；患者入院后24 h內(nèi)簽字出院；妊娠婦女；免疫抑制疾病；近1個(gè)月內(nèi)的感染性疾病病史；合并嚴(yán)重肝腎功能不全。另從同期我院擬行胃部ESD術(shù)的消化科住院患者中(病理證實(shí)非惡性腫瘤)隨機(jī)抽取40例作為陰性正常對(duì)照組。對(duì)照組患者無系統(tǒng)性疾病、惡性腫瘤史、急性及慢性感染，且在研究進(jìn)行時(shí)無其他用藥。本研究通過復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(Y2016-156)。所有研究對(duì)象知情同意且簽署知情同意書。

1.2 急性胰腺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)2012亞特蘭大急性胰腺炎分類標(biāo)準(zhǔn)，患者病情分級(jí)：輕度、中度、重度。急性胰腺炎的局部并發(fā)癥定義為急性胰周積液、胰腺假性囊腫、急性壞死性積聚和包裹性壞死，按照患者影像學(xué)資料整理。患者病因分類定義為膽源性、高三酰甘油血癥、酒精性及其他。根據(jù)修訂版Marshall評(píng)分系統(tǒng)，呼吸、心血管或腎臟系統(tǒng)中任一系統(tǒng)得分≥2分即可診斷為器官衰竭。

1.3 影像學(xué)評(píng)估 通過本院電子醫(yī)療系統(tǒng)搜集入院急診當(dāng)時(shí)CT及后續(xù)隨訪CT影像學(xué)資料及報(bào)告，CT局部并發(fā)癥的標(biāo)準(zhǔn)依照CT severity score(The Balthazar Score)的CT影像學(xué)分級(jí)定義。

1.4 預(yù)后不良事件定義 患者收治入重癥監(jiān)護(hù)室ICU治療，安置小腸營養(yǎng)管或腸外營養(yǎng)，住院天數(shù)≥15 d，死亡，發(fā)生任意器官衰竭(根據(jù)Marshall評(píng)分定義)。其中，同時(shí)發(fā)生多個(gè)事件的患者也定義為預(yù)后不良。

1.5 循環(huán)中PCSK 9水平測定 患者入院當(dāng)日完善診斷后，經(jīng)肘靜脈抽取靜脈血2 mL，置于含EDTA的試管中，1 200×g離心10 min，取血清，-80℃冰箱保存于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA法)測定血清中的PCSK9水平。ELISA實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照艾博抗公司經(jīng)銷的ab209884-Human PCSK9 Simple Step ELISA Kit說明書進(jìn)行。同期搜集患者及對(duì)照組入院當(dāng)日血檢資料。

2 結(jié) 果

2.1 各組患者一般資料的對(duì)比 結(jié)果(表1)表明：與對(duì)照組對(duì)比，急性胰腺炎患者(AP)各組年齡構(gòu)成比(P=0.163 2)，性別比(P=0.959 5)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。患者入院當(dāng)天血液生化和常規(guī)檢驗(yàn)資料(表2)表明：患者各組PCSK9水平均與對(duì)照組相比差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.018 7)。

表1 AP組與對(duì)照組基本資料比較

MAP:輕度急性胰腺炎(mild acute pancreatitis);MSAP：中度急性胰腺炎(moderately severe acute pancreatitis)；SAP：重度急性胰腺炎(severe acute pancreatitis)

指 標(biāo)對(duì)照組MAPMSAPSAPPCSK9 (ng/mL)30.48±5.71336.11±4.711?39.61±2.346△△42.95±1.048▲▲C-反應(yīng)蛋白 (mg/L)1.772±0.683 730.03±15.3541.08±99.1295.12±78.24降鈣素原 (ng/mL)0.201 5±0.153 10.295±0.1791.524±1.0421.262±2.369白細(xì)胞計(jì)數(shù) (×109/L)6.356±1.70412.07±2.7349.568±3.99013.69±3.729淀粉酶 (U/L)96.85±31.021 334±1 1121 515±1 359865.6±1 159脂肪酶 (U/L)25.94±13.4539.0±731.1870.6±683.9981.1±430.2白蛋白 (g/L)45.9±5.74239.78±5.01938.73±2.00541.44±3.110ALT (U/L)31.67±9.74474.44±65.16126.4±144.389.56±100.7AST (U/L)27.83±7.032103.7±113.8169.4±204.763.78±70.70TCH (mmol/L)54.2±37.66136.9±31.92141.3±36.97240.4±124.8TG (mmol/L)10.29±5.90282.75±44.03150.8±106.9566.6±758.1HDL (mmol/L)38.7±6.87645.30±22.4330.77±8.42927.76±11.60LDL (mmol/L)77.79±4.95175.20±28.3379.81±23.6593.90±30.86Lipo(α) (mg/L)144.8±96.49240.8±231.3213.0±162.665.49±60.15紅細(xì)胞計(jì)數(shù) (×1012/L)5.089±0.400 14.507±0.594.515±0.757 94.972±0.816 1血紅蛋白 (g/L)153.9±14.02138.0±16.72136.2±25.15154.9±26.15紅細(xì)胞比容 (%)44.64±2.90241.72±4.71641.41±7.87144.16±5.284血小板計(jì)數(shù) (×109/L)233.5±68.09219.6±98.28223.7±102.4221.8±79.79血尿素氮 (mmol/L)5.228±1.3095.844±1.2555.555±1.2395.600±2.539血清肌酐 (mmol/L)82.51±22.7661.78±9.77076.09±20.3177.67±37.21TNF-α (pg/mL)15.76±11.208.433±2.51516.09±4.08115.59±3.260IL-2R (pg/mL)419.7±160.8442.3±158.0763.6±318.2674.7±307.4IL-6 (pg/mL)4.223±5.623115.7±139.852.42±26.0667.35±54.92IL-8 (pg/mL)10.23±13.749.333±3.21523.79±3.91427.27±12.47IL-10 (pg/mL)7.337±3.7887.067±3.5809.191±3.9658.539±3.623Na+ (mmol/L)138.6±6.797140.6±3.127140.3±1.489138.2±3.623Mg2+ (mmol/L)0.858±0.111 50.835±0.0780.795 9±0.0710.903 3±0.254 3D-二聚體 (mg/L)0.374 7±0.207 82.834±2.7074.205±2.0141.866±1.940

ALT：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；AST：門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；TCH：血總膽固醇；TG：三酰甘油；HDL：高密度脂蛋白；LDL：低密度脂蛋白；Lipo(a)：脂蛋白a；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-2R：白細(xì)胞介素-2受體；IL-6：白細(xì)胞介素-6；IL-8：白細(xì)胞介素-8；IL-10：白細(xì)胞介素-10；Na+：血清鈉離子濃度；Mg2+：血清鎂離子濃度. 將患者依照亞特蘭大分類標(biāo)準(zhǔn)分層與正常對(duì)照組進(jìn)行單因素的ordinary one-way ANOVA檢驗(yàn)，F(xiàn)(3，27)=3.941，P=0.018 7，進(jìn)一步的Dunnett’s multiple comparisons test多重比較結(jié)果表明，對(duì)照組與輕度(Md=-5.866，*P=0.013 9)，中度(Md=-8.757，△△P=0.003 0)和重度(Md=-10.90，▲▲P<0.000 1)胰腺炎患者差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2.2 血清PCSK9在急性胰腺炎患者組中顯著升高 結(jié)果表明，急性胰腺炎患者組血清PCSK9水平[(38.51±4.043) ng/mL]高于對(duì)照組[(30.78±4.454)ng/mL]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000 4)。進(jìn)一步分析顯示：將患者依照亞特蘭大分類標(biāo)準(zhǔn)分層為輕度、中度和重度急性胰腺炎，與正常對(duì)照組進(jìn)行單因素ordinary one-way ANOVA檢驗(yàn)(P=0.018 7)，進(jìn)一步的多重比較結(jié)果表明，對(duì)照組與輕度(P=0.013 9)、中度(P=0.003 0)和重度(P<0.000 1)胰腺炎患者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

2.3 血清PCSK9水平是急性胰腺炎局部并發(fā)癥發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素

2.3.1 局部并發(fā)癥發(fā)生與否的單因素Logistic回歸分析 以患者病程中是否發(fā)生局部并發(fā)癥為因變量，進(jìn)行單因素Logistic回歸分析顯示，PCSK9、AMY、AST、Lipo(a)、TNF-α、ALT、WBC、LDL水平是影響急性胰腺炎患者發(fā)生局部并發(fā)癥與否的主要因素；性別、年齡、病因、入院時(shí)收縮壓(systolic blood pressure, SBP)以及其余血檢資料等因素差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

表3 局部并發(fā)癥單因素Logistic回歸分析

2.3.2 局部并發(fā)癥發(fā)生與否的多因素Logistic回歸分析 進(jìn)一步的多因素Logistic回歸分析顯示，診斷當(dāng)日血清中PCSK9水平(P=0.030，OR=1.595)是影響急性胰腺炎患者病程中局部并發(fā)癥發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，ALT水平(P=0.037，OR=0.973)是影響急性胰腺炎患者病程中局部并發(fā)癥發(fā)生的獨(dú)立保護(hù)因素(表4)。

表4 局部并發(fā)癥多因素Logistic回歸分析

2.4 d3與d10的PCSK9水平變化差值可預(yù)測預(yù)后不良相關(guān)事件

2.4.1 預(yù)后不良相關(guān)事件的Logistic單因素回歸分析 預(yù)后不良事件統(tǒng)計(jì)如下：收治入重癥監(jiān)護(hù)室ICU治療(2例)，安置小腸營養(yǎng)管或腸外營養(yǎng)(2例)，住院天數(shù)≥15 d(14例)，死亡(1例)，發(fā)生任意器官衰竭(10例)。以患者病程中是否發(fā)生預(yù)后不良相關(guān)事件為因變量，進(jìn)行單因素Logistic回歸分析顯示，PCSK9，診斷第3天血清與入院后第10天血清(d3與d10)PCSK9水平變化差值(ΔPCSK9)，入院當(dāng)日血糖(Glucose)，C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)，高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)，乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)及白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)水平是影響急性胰腺炎患者發(fā)生預(yù)后不良事件的主要因素；性別、年齡、病因、血WBC、AMY及其余血檢資料等因素差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表5)。

表5 預(yù)后不良事件單因素Logistic回歸分析

ΔPCSK9：診斷第3天與入院后第10天(d3與d10)患者血清PCSK9水平差值

2.4.2 預(yù)后不良相關(guān)事件的Logistic多因素回歸分析 進(jìn)一步的多因素Logistic回歸分析顯示，診斷第3天血清與入院后第10天血清(d3與d10)PCSK9水平變化差值(P=0.026，OR=0.085)是急性胰腺炎患者病程中預(yù)后不良事件發(fā)生的獨(dú)立保護(hù)因素(表6)。

表6 預(yù)后不良相關(guān)事件的Logistic多因素回歸分析

2.5 PCSK9水平與伴發(fā)高脂血癥的相關(guān)性

2.5.1 PCSK9在d0與HDL及TG呈相關(guān)性 在d0，患者血清PCSK9與HDL及TG具有相關(guān)性，同時(shí)與TCH、LDL沒有相關(guān)性(表7)。

表7 患者入院時(shí)(d0)血清PCSK9水平與脂代謝

2.5.2 PCSK9在d10與TG不再具有相關(guān)性 在d10時(shí)間節(jié)點(diǎn)，PCSK9只與HDL在P<0.05水平具有相關(guān)性，不再與TG呈現(xiàn)相關(guān)性(表8)。并且無論在d0還是d10，PCSK9均未體現(xiàn)出與LDL的相關(guān)性。鑒于這種相關(guān)性的從有到無，可以認(rèn)為，在急性胰腺炎中的PCSK9水平的升高，至少與LDL及其受體的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)并非具有明確的相關(guān)性，亦不具備因果關(guān)系的條件，并且與急性胰腺炎中TG的升高也不具備直接的相關(guān)性與因果關(guān)系。

表8 患者入院后第10天(d10)血清PCSK9水平與脂代謝

3 討 論

急性胰腺炎是全身炎癥反應(yīng)，其急性過程中發(fā)生的腸道菌群轉(zhuǎn)位，造成LPS入血、內(nèi)毒素血癥和炎癥反應(yīng)的加劇[16]。對(duì)于急性胰腺炎的血清標(biāo)志，目前采用的AMY及LIP不足以單獨(dú)評(píng)估AP的嚴(yán)重程度及AP并發(fā)癥的發(fā)生率，并且對(duì)于AP預(yù)后的預(yù)測價(jià)值有限；目前使用的各種臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)亦有其局限性，尋找新的AP血清學(xué)標(biāo)志和疾病預(yù)測指標(biāo)很有必要。

PCSK9是LDLR相關(guān)蛋白調(diào)控子，生理作用下與脂代謝及LPS從血液循環(huán)中的清除密切相關(guān)，其水平不僅受血脂水平的調(diào)控，還被細(xì)菌、病毒等病原體感染后產(chǎn)生的LPS和其他炎癥因子所調(diào)控。我們以及其他學(xué)者的研究[11-14]表明將PCSK9作為目標(biāo)靶點(diǎn)，可能對(duì)膿毒血癥有保護(hù)作用。

鑒于上述理論和工作基礎(chǔ)，我們推測PCSK9可能在急性胰腺炎發(fā)生和發(fā)展過程中產(chǎn)生一定的變化。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCSK9在急性胰腺炎患者中顯著升高；經(jīng)過分層統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，PCSK9升高在MAP、MSAP及SAP均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；進(jìn)一步Logistic回歸分析顯示，PCSK9升高是急性胰腺炎局部并發(fā)癥發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，PCSK9水平在d3與d10間下降不明顯是不良預(yù)后事件發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。因此，PCSK9升高水平可以作為急性胰腺炎嚴(yán)重程度及局部并發(fā)癥的預(yù)測因素。PCSK9在患者急性胰腺炎嚴(yán)重程度分層方面可能具有潛在的作用，并且這種作用是獨(dú)立于其他常用急性炎性標(biāo)志物(如CRP、ESR)以及常用的胰腺炎血清標(biāo)志物AMY、LIP的。

急性胰腺炎中引起PCSK9升高的具體分子作用機(jī)制尚不明確；正常生理狀態(tài)下血清中PCSK9水平變化主要受到血脂代謝調(diào)控，然而炎癥反應(yīng)過程也會(huì)導(dǎo)致PCSK9水平的上調(diào)[10]。在急性胰腺炎中，除了內(nèi)毒素血癥外，患者還往往存在血脂代謝的紊亂，高三酰甘油血癥和高膽固醇血癥[18-19]。所以，PCSK9在急性胰腺炎中的水平變化，是受血脂代謝過程中LDLR調(diào)控的因素影響，還是和急性胰腺炎的炎癥反應(yīng)相關(guān)，暫未明確。本研究統(tǒng)計(jì)分析顯示，PCSK9血清水平的升高在d0時(shí)間節(jié)點(diǎn)與HDL及TG具有相關(guān)性，同時(shí)與TCH、LDL沒有相關(guān)性，而在d10，PCSK9血清水平不再與TG具有相關(guān)性，并且在這兩個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)，PCSK9水平均與LDL不具備相關(guān)性，鑒于這種相關(guān)性在時(shí)間上不具備連續(xù)性，提示在急性胰腺炎中的PCSK9水平的升高，與LDL及其受體的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)并不具有明確的相關(guān)性。

研究結(jié)果提示在急性胰腺炎過程中，主要是由于內(nèi)毒素血癥，LPS升高，刺激肝細(xì)胞合成和分泌PCSK9增加引起的。在實(shí)際中，患者因急性胰腺炎造成PCSK9水平增高，導(dǎo)致肝細(xì)胞表面LDLR減少，從而造成LPS從血流中清除減少[20]，進(jìn)一步導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)的繼續(xù)，在胰腺局部則表現(xiàn)為局部并發(fā)癥的發(fā)生，在整體則表現(xiàn)為預(yù)后不良，整體臨床病程反復(fù)。當(dāng)然，內(nèi)毒素相關(guān)的反應(yīng)性血脂代謝紊亂，也可能是血清PCSK9反應(yīng)性升高的一種潛在可能；這需要體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型去進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，PCSK9可作為新的急性胰腺炎診斷的分子，對(duì)于AP局部并發(fā)癥的預(yù)測以及患者整體預(yù)后的預(yù)測有一定的作用，也可作為急性胰腺炎潛在的治療靶點(diǎn)，值得今后繼續(xù)研究。