油茶蒲不同溶劑粗提液的總黃酮提取率與抗氧化活性比較

吳蘇喜,吳美芳 ,謝妍祎,周青青,譚傳波, 張謙益

(1.長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與食品工程學(xué)院，長(zhǎng)沙 410114； 2.湖南大三湘茶油股份有限公司，湖南 衡陽(yáng) 421141；3.道道全糧油股份有限公司，湖南 岳陽(yáng) 414000)

油茶(Camelliaoleifera)是我國(guó)特有的茶科山茶屬多年生木本油料植物，從油茶果中榨取的油茶籽油營(yíng)養(yǎng)豐富，富含油酸，被譽(yù)為“東方橄欖油”[1]。油茶蒲是油茶果的外皮，也叫油茶果殼，占油茶鮮果質(zhì)量的 60%～70%，是油茶加工的重要副產(chǎn)物，年產(chǎn)量達(dá)200萬(wàn)t[2]。目前，油茶蒲利用效率極低[3]，除少量用作有機(jī)肥料、活性炭生產(chǎn)原料以及食用菌栽培原料以外，大多數(shù)被廢棄或焚燒，既浪費(fèi)資源，又污染環(huán)境。因此，探索油茶蒲的高效利用途徑，已成為油茶產(chǎn)業(yè)急需解決的熱點(diǎn)問(wèn)題，并具有重要應(yīng)用價(jià)值和科學(xué)意義。

根據(jù)研究[4]報(bào)道，油茶蒲中含有黃酮、多酚、皂苷、多糖等成分，這些成分具有許多生物活性，如抗氧化活性、清除自由基活性等，可作為生物醫(yī)藥原材料。于是，人們開(kāi)始研究油茶蒲中有效成分的提取。目前，提取黃酮類化合物所用溶劑主要有甲醇[5]、乙醇[6-7]，同時(shí)采用分級(jí)萃取的方式富集不同極性的黃酮類化合物，常用萃取劑包括乙酸乙酯[3]、正丁醇[8]、氯仿、水[9]、石油醚[10]。劉朝旭等[11]采用微波法提取甘草黃酮，得率為3.01%，同時(shí)甘草總黃酮具有較好的DPPH·清除能力。高進(jìn)勇等[12]采用95%乙醇提取油茶粕中黃酮類化合物，并探索了其分子組成及抗氧化活性，得出醇提黃酮類化合物清除 DPPH·半抑制濃度(IC50) 為 0.44 mg /mL。肖燕等[13]利用乙醇提取油茶枯餅的黃酮類化合物，并進(jìn)行抗氧化實(shí)驗(yàn)，研究表明油茶枯餅中黃酮類化合物對(duì)DPPH·具有明顯的清除效果。但目前人們對(duì)不同溶劑的黃酮提取效果及其提取物的抗氧化活性缺乏比較研究。本文采用各具5個(gè)體積分?jǐn)?shù)梯度的5種有機(jī)溶劑對(duì)油茶蒲進(jìn)行超聲輔助浸提而得到25種粗提液，測(cè)定各粗提液的黃酮提取率和清除DPPH·的能力，可為油茶蒲有效成分的提取和開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

油茶蒲：由湖南瀏陽(yáng)聚康油茶種植專業(yè)合作社提供的2017年油茶鮮果經(jīng)陰干、裂果而得。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)，中國(guó)醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司；1,1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)，分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、1,3-丁二醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

UV 5200型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限責(zé)任公司；XH- 2008DE型智能溫控雙頻超聲波萃取儀，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 油茶蒲粉的制備

油茶蒲經(jīng)粉碎和過(guò)篩(80目)處理得到油茶蒲粉，裝瓶密封備用。

1.2.2 提取劑的配制

分別量取適量的無(wú)水乙醇、1,3-丁二醇、丙酮、甲醇、乙酸乙酯溶劑于容量瓶，用去離子水定容至刻度(乙酸乙酯用無(wú)水乙醇定容)，分別得到5種溶劑的不同體積分?jǐn)?shù)(20%、40%、60%、80%、100%)提取劑。

1.2.3 油茶蒲粗提液的制備

稱取油茶蒲粉2.0 g于錐形瓶，按料液比1∶15加入提取劑，蓋上瓶塞。將錐形瓶放入超聲波萃取儀內(nèi)，在頻率40 kHz、萃取溫度60℃條件下進(jìn)行超聲輔助浸提45 min，趁熱抽濾，用相應(yīng)提取劑洗滌濾渣，再抽濾。合并濾液，用提取劑定容至100 mL，得到粗提液。

1.2.4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取0.0153 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用無(wú)水乙醇溶解并定容至50 mL，得到306 μg/mL蘆丁貯備液。精確吸取蘆丁貯備液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL分別放入10 mL比色管中，加入50 mg/mL亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻靜置6 min，再加入 10 mg/mL硝酸鋁溶液0.3 mL ，搖勻靜置6 min，加入4 mg/mL氫氧化鈉溶液4.0 mL，搖勻，用蒸餾水定容至10 mL刻度線，靜置15 min，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為A=0.005 2C+0.006 9(R2=0.999 1)。

1.2.5 粗提液總黃酮含量的測(cè)定及其提取率計(jì)算

精確吸取油茶蒲粗提液1.0 mL置于10 mL比色管中，按照1.2.4方法加入有關(guān)試劑，測(cè)定其吸光度(Ai)，以蒸餾水做空白對(duì)照測(cè)定吸光度(A0)。根據(jù)回歸方程計(jì)算測(cè)定液中的總黃酮質(zhì)量濃度(Ci)，再根據(jù)相應(yīng)稀釋倍數(shù)計(jì)算粗提液中總黃酮質(zhì)量濃度、質(zhì)量和總黃酮提取率。

粗提液中總黃酮質(zhì)量濃度=10Ci

粗提液中總黃酮質(zhì)量=100×10Ci

1.2.6 粗提液清除DPPH·的能力測(cè)定

參考董蕊等[14]的方法，用無(wú)水乙醇配制1 mmol/L DPPH溶液，置于4℃冰箱備用。實(shí)驗(yàn)前，用無(wú)水乙醇稀釋至0.1 mmol/L。取油茶蒲粗提液2 mL于試管中，加入0.1 mmol/L DPPH溶液2 mL，混勻后在室溫暗處避光反應(yīng)30 min。在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，以等體積提取溶劑和無(wú)水乙醇混合液為空白調(diào)零；每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。按下式計(jì)算DPPH·的清除率。

清除率=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%

式中：A0為等體積無(wú)水乙醇代替供試品測(cè)得的吸光度；Ai為試樣的吸光度；Aj為等體積無(wú)水乙醇代替DPPH 測(cè)得的吸光度。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用MS Excel 2010處理，進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑種類和體積分?jǐn)?shù)對(duì)油茶蒲總黃酮提取率的影響

利用各5種體積分?jǐn)?shù)的5種提取劑超聲輔助浸提油茶蒲，得到25種油茶蒲粗提液，各粗提液的總黃酮提取率見(jiàn)圖1。

由圖1可見(jiàn)，同一種提取劑的不同體積分?jǐn)?shù)對(duì)油茶蒲的總黃酮提取率有顯著影響。除了甲醇以外，基于總黃酮提取率比較的其他提取劑(乙醇、乙酸乙酯、1,3-丁二醇和丙酮)的最佳體積分?jǐn)?shù)均為60%，這與沈建福等[15]報(bào)道的提取油茶殼中總黃酮的乙醇最佳體積分?jǐn)?shù)為60%結(jié)果一致。甲醇溶液最佳體積分?jǐn)?shù)為80%。丙酮對(duì)于提取油茶蒲總黃酮具有顯著優(yōu)勢(shì)?；诳傸S酮提取率大小順序排列的5種溶劑及其對(duì)應(yīng)的總黃酮提取率依次是60%丙酮溶液(6.28%)、 60%乙醇溶液(5.24%)、80%甲醇溶液(4.82%)、60%1,3-丁二醇溶液(4.40%)、60%乙酸乙酯-乙醇溶液(4.13%)。但是，鑒于丙酮、甲醇的毒性較大，故可選用 60%乙醇溶液作為油茶蒲總黃酮提取劑。

圖1 不同體積分?jǐn)?shù)的5種提取劑對(duì)油茶蒲總黃酮的提取率

2.2 提取劑種類和體積分?jǐn)?shù)對(duì)油茶蒲粗提液清除DPPH·能力的影響

采用不同種類不同體積分?jǐn)?shù)的提取劑提取的油茶蒲粗提液處理DPPH溶液，對(duì)DPPH·的清除能力見(jiàn)圖2。

圖2 25種油茶蒲粗提液對(duì)DPPH·的清除率

由圖2可見(jiàn)，油茶蒲的不同溶劑粗提液對(duì)DPPH·的清除率都在70%以上，但相互之間存在較大的差異。除60%乙酸乙酯-乙醇溶液的油茶蒲粗提液對(duì)DPPH·的清除率最高(92.69%)以外，其他4種溶劑對(duì)應(yīng)的DPPH·清除率都隨著提取劑體積分?jǐn)?shù)的增大而增大，在提取劑體積分?jǐn)?shù)達(dá)100%時(shí)的DPPH·清除率最大，其中100%乙醇溶液對(duì)應(yīng)的DPPH·清除能力(92.78%)與60%乙酸乙酯-乙醇溶液相應(yīng)能力接近，而60%乙醇溶液對(duì)應(yīng)的自由基清除率只有81.09%?；贒PPH·清除率大小順序排列的5種粗提液及其對(duì)應(yīng)的清除率依次是100%乙醇溶液提取物(92.78%)、60%乙酸乙酯-乙醇溶液提取物(92.69%)、100%1,3-丁二醇溶液提取物(89.68%)、100%甲醇溶液提取物(86.54%)、100%丙酮溶液提取物(81.99%)。

2.3 最優(yōu)提取劑種類和體積分?jǐn)?shù)的確定

由圖2可見(jiàn)，極性溶劑粗提液對(duì)DPPH·的清除率隨著提取劑體積分?jǐn)?shù)的增大而增大，在提取劑體積分?jǐn)?shù)達(dá)100%時(shí)DPPH·清除率最大。以乙醇粗提液為例，不同體積分?jǐn)?shù)乙醇提取物的DPPH·清除率基本呈線性增加，100%乙醇溶液提取物的DPPH·清除率達(dá)到92.78%，遠(yuǎn)大于60%乙醇溶液提取物的DPPH·清除率81.09%。這與2.1中所述不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液的總黃酮提取率呈現(xiàn)不一致趨勢(shì)，其原因可能是：乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)大于60%以后，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，所提取出來(lái)的活性物質(zhì)除了黃酮以外還有其他物質(zhì)，如多糖、多酚、皂素等，而這些物質(zhì)具有DPPH·清除活性。張金磊等[16]用90%乙醇溶液提取麻瘋樹(shù)果殼多糖，得率為5.75%，同時(shí)得出乙醇體積分?jǐn)?shù)增大則多糖得率增加的結(jié)論；王銳等[17]研究了貓爪草的多酚提取工藝，最佳乙醇提取體積分?jǐn)?shù)為75%，其多酚浸出量為251.4 μg/g；李柏榆等[18]采用超聲輔助提取桑葚多酚，得出其最佳乙醇提取體積分?jǐn)?shù)為70%，總酚提取率為4.014%；李小然等[19]采用微波輔助堿性70%乙醇提取茶葉籽中茶皂素，可以顯著提高茶皂素得率，得率為21.64%。這些研究表明了溶出多糖、多酚、皂素等抗氧化活性成分的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)大于60%。但是，這些黃酮以外活性物質(zhì)的存在顯然會(huì)增大粗提液的后續(xù)純化難度。

由圖2可見(jiàn)，弱極性溶劑(乙酸乙酯)粗提液對(duì)DPPH·的清除率隨著提取劑體積分?jǐn)?shù)的增大呈現(xiàn)先增加后穩(wěn)定再減少的趨勢(shì)，在體積分?jǐn)?shù)60%時(shí)對(duì)應(yīng)的DPPH·清除率達(dá)最大值(92.69%)，這與2.1中所述乙酸乙酯-乙醇溶液的總黃酮提取率變化趨勢(shì)基本相似。

由圖1還可見(jiàn)，60%乙酸乙酯-乙醇溶液對(duì)應(yīng)的總黃酮提取率(4.13%)只略小于40%乙醇溶液對(duì)應(yīng)的黃酮提取率(4.24%)，但遠(yuǎn)大于100%乙醇溶液對(duì)應(yīng)的總黃酮提取率(2.84%)，60%乙酸乙酯-乙醇溶液對(duì)應(yīng)的DPPH·清除率(92.69%)卻非常接近100%乙醇溶液對(duì)應(yīng)的DPPH·清除率(92.78%)。綜合考慮2.1和2.2的研究結(jié)果，采用60%乙酸乙酯-乙醇溶液作為提取劑，所得粗提液不僅對(duì)DPPH·的清除率可達(dá)92%以上，還可以使粗提液中的活性成分相對(duì)單純，便于后期精制純化。同時(shí)，圖2顯示，40%乙酸乙酯-乙醇溶液、80%乙酸乙酯-乙醇溶液與60%乙酸乙酯-乙醇溶液所對(duì)應(yīng)的DPPH·的清除率相差不大，這也比較適合工業(yè)化生產(chǎn)容易發(fā)生乙酸乙酯濃度波動(dòng)的實(shí)際需要。因此，采用60%乙酸乙酯-乙醇溶液作為提取劑制取油茶蒲粗提液，是一種比較理想的選擇。

3 結(jié) 論

(1)綜合考慮總黃酮提取率和DPPH·清除率以及工業(yè)化應(yīng)用的可行性，適合油茶蒲有效利用的最佳提取劑是60%乙酸乙酯-乙醇溶液，總黃酮提取率達(dá)4.13%，所對(duì)應(yīng)提取物對(duì)DPPH·清除率達(dá)92.69% ，是一種適應(yīng)工業(yè)化開(kāi)發(fā)利用油茶蒲黃酮的理想溶劑。

(2)總黃酮提取率最高的油茶蒲提取物所對(duì)應(yīng)的DPPH·清除能力并不是最強(qiáng)的，說(shuō)明油茶蒲提取物中的抗氧化成分除了黃酮以外，還有其他值得開(kāi)發(fā)利用的抗氧化活性成分(如多酚、皂素、多糖)，說(shuō)明油茶蒲具有良好的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。